维吾尔族肺腺癌患者的EGFR基因突变分析

单莉 张琰 赵峰 郑立谋 张国庆

肺癌是世界范围内常见的癌症，发病率和死亡率居各癌症之首。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万。肺癌已经成为发病率和死亡率第1位的恶性肿瘤，其5年生存率仅为15%[1-3]。表皮生长因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种跨细胞膜糖蛋白，属于受体型酪氨酸激酶，EGFR信号通路在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥着重要调节作用。EGFR基因在多种肿瘤中存在突变或过表达，并通过其介导的信号通路调控肿瘤的生长、侵袭、转移和血管新生[4-6]。以吉非替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）靶向药物在肺癌的治疗中显示出良好的治疗效果，然而，该类药物的治疗效果在不同个体间存在很大差异。多项临床研究[5,7-12]显示，EGFR基因外显子18-21突变是导致不同个体间治疗效果差异的主要原因。因此，根据EGFR基因突变检测结果选择合适的治疗对象，对于提高患者治疗效果、延长患者的生存期有重要意义。目前，已有的肺癌EGFR突变研究还没有针对维吾尔族突变率的报道。本研究检测了68例维吾尔族和70例汉族肺癌患者的EGFR基因，首次报道了维吾尔族肺癌EGFR基因突变率，并对维吾尔族和汉族EGFR基因突变率进行了比较。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集医院维吾尔族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本68例，其中男性39例，女性29例；年龄30岁-75岁，中位年龄52岁。汉族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本70例，其中男性49例，女性21例；年龄35岁-79岁，中位年龄57岁。

1.2 标本采集与DNA提取 采用病理石蜡切片样品，5 μm切片，不少于8片，室温保存。所用样品均为病理诊断确定含有肿瘤组织的蜡块切片，并且保存时间不超过两年。取石蜡标本组织，用QIAGEN公司核酸提取试剂盒提取（QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit，商品号：564074）DNA， 所提DNA溶于Tris-HCl（10 mmol/L, pH8.0），经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液（10 mmol/L, pH 8.0）调整DNA浓度到10 ng/μL和2 ng/μL备用。

1.3 实时荧光PCR扩增 采用ARMS （amplification refractory mutation system, ARMS）方法进行PCR扩增，检测EGFR基因外显子18、19、20和21突变。用厦门艾德生物医药科技公司EGFR基因突变检测试剂盒（人类EGFR基因21种突变检测试剂盒）进行检测，实验具体操作步骤参照试剂盒说明书进行操作。采用StrataGene MX3000P实时PCR仪进行扩增，每次检测样品包括1个阳性质控品、1个NTC对照。如果Ct值为0或Ct值＞30，则实验结果判为野生型。所述荧光PCR的反应条件：95oC预变性5 min，1个循环；95oC变性25 s，64oC退火20 s，72oC延伸20 s，15个循环；93oC变性25 s，60oC退火35 s，72oC延伸20 s，31个循环。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，采用χ2和Fisher精确检验分析突变差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

共检测138例肺腺癌的样本，包括68例维吾尔族、70例汉族，共检测出43例突变，检测总突变率为31.2%。维吾尔族突变11例，突变率为16.2%，汉族突变32例，突变率为45.7%，以外显子19和21突变较为多见。维吾尔族EGFR突变率明显低于我国汉族EGFR突变率（χ2=14.03,P＜0.001），结果见表1，突变比例分析图见图1。

在检测的肺腺癌EGFR基因突变中，突变点包括19-del突变和外显子21的L858R突变，其中维吾尔族外显子19-del突变6例，占突变数的54.5%，L858R突变5例，占突变数的45.5%。汉族19-del突变12例，占突变数的37.5%。L858R突变20例，占突变数的62.5%。 维吾尔族外显子19和外显子21（L858R）的突变率与汉族外显子19和外显子21（L858R）的突变率相比无明显差异（P=0.48）（表2）。

图 1 维吾尔族与汉族肺腺癌EGFR基因突变比较Fig 1 Histog ram com parison o f EGFR m u tations betw een Uighu r lung ad enocarcinom a and Han lung adenocarcinom a. EGFR: ep id erm a l g row th factor recep tor.

表 1 维吾尔族与汉族肺腺癌EGFR基因突变统计结果Tab 1 EGFR m u tation com parison betw een Uighu r lung adenocarcinom a and Han lung adenocarcinom a

表 2 EGFR基因外显子19与外显子21突变分析Tab 2 The analysis o f EGFR m utations in Exon 19 and Exon 21

3 讨论

EGFR属于表皮生长因子ErbB家族，该家族包括HER1、HER2、HER3和HER4四个成员。EGFR是一种细胞表面膜蛋白受体，由1,186个氨基酸组成，分子量为170 kDa，由三个功能不同的结构域组成，包括胞外区、跨膜区和细胞内的酪氨酸区[13]。当EGFR与其相应的信号分子结合后，受体分子之间会形成二聚体，两个受体胞内的酪氨酸激酶彼此作用而相互磷酸化，并启动胞内的级联信号通路，从而引起细胞内一系列形态学的改变[13-15]。

EGFR基因在多种肿瘤会存在突变或者过表达，并通过其下游信号通路调控肿瘤的生长、增殖和转移。目前，常用EGFR-TKIs主要包括吉非替尼和厄洛替尼，是治疗肺癌最有效的靶向药物。然而，该类药物对EGFR突变患者的有效率高达80%以上，而对野生型患者几乎没有疗效，因此，检测EGFR的突变情况是肺癌化疗预后重要标志物。研究表明，不同人种肺癌的EGFR突变率差异较大，Schm id等[16]和Kris等[17]通过对大量肺癌病例研究发现，高加索人（Caucasian）肺癌EGFR突变率约为7%-17%。Li等[18]通过对202例肺腺癌患者发现，我国汉族人的肺腺癌EGFR突变率为75.3%。Han[19]和Hsu等[20]的研究进一步表明，东亚人的肺腺癌EGFR突变率约为30%-62%。本研究首次对维吾尔族肺腺癌EGFR突变进行检测，检测结果表明维吾尔族肺腺癌EGFR突变率为16.2%，其突变率明显低于我国汉族肺腺癌EGFR突变率，略高于高加索人EGFR突变率。本研究对维吾尔族肺腺癌EGFR突变检测为临床医生提供了重要参考信息，有益于其肺腺癌的个体化治疗。

从地域分布来看，汉族人与日本人居源于东亚大陆，高加索人居源于欧洲大陆，维吾尔族人居于欧洲大陆和东亚大陆之间。居源于东亚大陆人肺腺癌EGFR突变率较高，居源于欧洲大陆的人肺腺癌EGFR突变率较低，维吾尔族人所居区域突变率介于两者之间，肺腺癌EGFR突变率从欧洲大陆到东亚大陆表现出突变率逐渐增大的趋势。

肺腺癌EGFR基因外显子19缺失突变是吉非替尼类药物作用的关键靶点，其缺失突变可引起酪氨酸激酶结构域中4个氨基酸残基的缺失，从而导致EGFR-ATP受体结合域的角度改变，使吉非替尼类药物更易结合到该位点，通过阻止ATP进入而阻断EGFR激酶活性[21]。本研究检测了68例维吾尔族和70例汉族肺腺癌EGFR基因，发现EGFR总突变率为31.2%，维吾尔族的突变率为16.2%，其中外显子19-del突变的突变率较高，占突变比例的54.5%。在汉族中EGFR突变率为45.7%，其中外显子19的缺失突变的突变率有12例，占突变比例的37.5%，维吾尔族EGFR基因外显子19缺失突变的突变率略高于汉族的外显子19缺失突变的突变率，分析表明维吾尔族肺腺癌EGFR基因外显子19突变率与汉族外显子19突变率差异无统计学意义（P=0.48）。

综上所述，本研究表明维吾尔族肺腺癌患者EGFR基因突变率明显低于我国汉族EGFR基因突变率。EGFR基因突变与EGFR-TKIs药物治疗敏感性明显相关，基于EGFR的突变情况来选择EGFR-TKIs的药物进行化疗已成为临床医生的共识，本研究首次提供维吾尔族肺腺癌的EGFR突变率信息，可以为临床医生提供有益参考，使广大肺腺癌患者受益。

Acknowledgement

We thank Qing Shao for great help in statistical analysis,data processing, language revision and fruitful discussions.