关于清热消炎宁片微生物检验的方法学验证研究

杨春媛

清热消炎宁片具有清热解毒，消炎止痛，舒筋活络的功效。用于治疗流行性感冒，咽喉炎，肺炎，菌痢，急性胃肠炎，阑尾炎，烧伤，疮疡脓肿，蜂窝织炎。其主要成分为九节茶。九节茶又名肿节风、草珊瑚等，是金粟兰科植物接骨金粟兰的枝叶。主要成份有香豆酮、黄酮甙、类脂、氰甙、挥发油和鞣酚等。主要药理作用有抗菌、镇痛、增强免疫功能、抗癌及促进骨折愈合等。本品还能促进细胞吞噬功能。其所含琥珀酸有镇痛作用，能促进早期成骨细胞增生，加快骨断端连接及骨髓腔再通，从而促进骨折愈合。肿节风还有抗癌、平喘及抗胃溃疡等药理作用。本品抗菌谱广，对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、肺炎双球菌、卡他球菌、流感杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等均有较强的抑制作用，其中的抑菌活性会干扰微生物限度检查的准确度。

1 实验用仪器和培养基

1.1 实验用培养基 玫瑰红钠培养基、营养琼脂培养基、胆盐乳糖增菌液、营养肉汤培养基、胆盐乳糖发酵培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、MUG培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9%氯化钠溶液。(培养基生产单位：北京三药科技开发公司)

1.2 实验用仪器 台州椒江YJA电动匀浆仪、上海博迅MJX-250B-Z型霉菌培养箱、上海博迅SPX-250B-Z型生化培养箱、上海JY2001型电子天平。

1.3 实验用菌种 白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］来源：中国生物制品检定所。

2 清热消炎宁片方法学验证［1］

2.1 实验菌液制备

2.1.1 黑曲霉菌液制备：将培养一周的黑曲霉斜面培养物，加含0.05%(ml/ml)聚三梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3 ml，将孢子洗脱。吸取孢子悬液约0.1 ml加入9 ml含0.05%(ml/ml)聚三梨酯80的生理盐水溶液中，经过10倍稀释至10-5至10-7稀释级，取菌数浓度约为50至100cfu/ml的活菌备用。

2.1.2 白色念珠菌菌液制备：将经25℃培养24 h的白色念珠菌液体培养物，2白金耳加入9 ml生理盐水溶液中，经过10倍稀释到10-4至10-6稀释级，取菌数浓度约为50至100cfu/ml的活菌备用。

2.1.3 三种细菌菌液制备：将经35℃培养24 h的枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌营养肉汤液体培养物2白金耳分别加入9 ml生理盐水溶液中，经过10倍稀释到10-4至10-6稀释级，取菌数浓度约为50至100cfu/ml的活菌备用。

2.2 实验用细菌、霉菌及酵母菌验证方法

2.2.1 1比10的供试液制备方法：取约10 g本品放匀浆杯中，加入100 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，以4000转/min运行2 min，摇匀，即制成1比10的供试液。

2.3 各实验菌的回收率测定

2.3.1 试验组操作方法：精密量取供试液1 ml，按供试品对照组同法操作，并且同时每个平皿加入50至100cfu相应试验菌夜1 ml，立即倾注对应的琼脂培养基，混匀，等培养基凝固后，置规定温度培养24～72 h，观察结果并计数。

2.3.2 供试品对照组操作方法：精密量取供试液1 ml，分别注入五个平皿中(每个平皿约加入0.2 ml供试液)；供试品本底的菌数测定结果见表1。

2.3.3 菌液组操作方法：精密量取5种菌各1 ml，分别注入平皿；立即倾注对应的琼脂培养基，凝固后置规定温度培养24～72 h，观察结果并计菌数，测定结果见表1。

2.4 结果

表1 各实验菌回收率测定结果

2.3.4 通过表1总结出：回收率实验采用培养基稀释法，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌三种细菌回收率均大于70%，由此得出可采用培养基稀释法测定细菌数；采用常规法测定霉菌及酵母菌数。

3 清热消炎宁片控制菌检查方法学验证［1］

3.1 实验菌液制备：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液稀释步骤同上述1.3，用无菌生理盐水溶液制成含10至100cfu/ml菌数的菌液。

3.2 实验用菌种：金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，大肠埃希菌［CMCC(B)44102］来源：中国生物制品检定所。

3.3 控制菌验证方法

3.3.1 阴性对照操作方法：精密量取10 ml稀释剂置增菌液中，按相应控制菌检查法检查。

3.3.2 阴性菌对照组操作方法：方法同试验组，但验证大肠埃希菌时的阴性对照菌是金黄色葡萄球菌。

3.3.3 试验组操作方法：精密量取规定量供试液及试验菌加入胆盐乳糖培养基增菌液中，并按相应控制菌检查法进行检查。

3.3.4 供试品组操作方法：精密量取1比10供试液10 ml置上述增菌液中，并按相应控制菌检查法进行检查。

表2 控制菌大肠埃希菌

4 由上表结果可以得出结论

阴性对照菌组未检出阴性对照菌(金黄色葡萄球菌)，而试验组检出大肠埃希菌，因此可按常规方法检查控制菌。

5 总结

经微生物限度检查方法学验证试验，清热消炎宁片微生物限度检查中，可采用培养基稀释法测定细菌数，采用常规法测定霉菌(酵母菌)数以及控制菌。

［1］ 《中华人民共和国药典》中国医药科技出版社，2010年版二部，附录ⅪJ，第107页．