胰岛素对促性腺激素释放激素分泌及活性的调控

朱宇旌 丁 兰 张 勇* 王 艳 张宝生

(1.沈阳农业大学牧医学院，沈阳 110866;2.凌源禾丰牧业有限责任公司，凌源 122500)

动物的能量代谢状况对动物的繁殖性能有重要影响，能量代谢状况如果发生变化，动物体内调节繁殖的激素就会相应发生变化。胰岛素(insulin，Ins)是动物体内能量代谢调控的重要激素。促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是动物体内调控繁殖的重要激素，是使动物发情的起始因素。虽然连接能量平衡和繁殖力的细胞及分子机制还不是很清楚，本文综述了胰岛素做为重要的代谢调控胞外信号，其对下丘脑中重要的启动生殖的激素GnRH的活性和作用的影响。近年来的研究表明，胰岛素影响GnRH分泌通过如下3条途径:1)早期生长应答蛋白-1(early growth response protein 1，Egr-1)途径，在胰岛素存在下，Egr-1可与GnRH启动子结合，提高启动子的活性，促进GnRH基因表达[1];2)胞外信号调节激酶(ERK)途径，GnRH在垂体促进促黄体素(luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(folliclestimulating hormone，FSH)分泌时主要依靠ERK作用，而胰岛素可影响ERK的活性，从而间接促进GnRH 基因表达[2-3];3)神经肽 Y(NPY)途径，NPY可以刺激或抑制GnRH脉冲发生器，而胰岛素可以调节NPY的活性[4-5]。

1 GnRH分泌与胰岛素的关系

哺乳动物的生殖周期是由下丘脑、脑垂体和生殖腺之间复杂的相互作用控制的;中枢神经系统中多种内分泌激素协同作用，才能启动母畜发情。动物生长发育到一定阶段，下丘脑对性腺类固醇激素敏感性降低，使GnRH合成和分泌增加，同时脑垂体和性腺对GnRH的敏感性增加，LH和FSH分泌，这二者作用于性腺促进雌二醇和孕酮分泌，动物发情被启动[6]。可以看出，在整个启动过程中，GnRH起到重要作用。

GnRH为10肽小分子，由下丘脑视交叉前区的GnRH神经元分泌，然后从正中隆起进入垂体门静脉系统，随血液进入垂体，刺激垂体细胞分泌LH和FSH[7]。GnRH呈脉冲式分泌，其分泌模式对外界信号非常敏感，例如限饲、环境温度过高或过低、过度使役等都会轻易抑制GnRH的脉冲式分泌。但是当外界刺激消除后，GnRH脉冲分泌只需1～2 h就会恢复。

胰岛素是动物体能量代谢调节的重要胞外信号，也是连接机体代谢变化与繁殖机能调整的重要信使。胰岛素可以通过血脑屏障，直接作用于下丘脑，将能量代谢状况信息传递至下丘脑。Woods等[8]最早研究发现动物胰岛素血液循环水平与机体脂肪沉积成比例，从而提出胰岛素在能量平衡中起重要作用。用基因打靶技术使小鼠胰岛素受体特异性神经元表达沉默可导致小鼠体脂沉积增加和GnRH释放减少，下丘脑的促性腺功能减退，最后出现不育[9]。因此推测胰岛素在动物繁殖过程中发挥重要作用，这些作用有可能是胰岛素直接促进GnRH分泌释放，也可能是间接作用于其他途径最终影响GnRH分泌释放。

2 胰岛素对GnRH分泌释放的调控

2.1 胰岛素促进GnRH基因表达的Egr-1途径

Egr-1基因是即早基因家族的成员，是一种锌指结构转录因子，该家族还包括c-jun、核转录因子кB(NF-кB)、c-fos、Egr-2、Egr-3、Egr-4 等基因[10]。这些基因在被生长因子、细胞因子和损伤刺激后迅速而瞬时地诱导表达，故称为即早基因家族[11]。Egr-1基因受到诱导后，其锌指DNA结合区域能与靶基因中富含鸟嘌呤胞嘧啶的顺式作用元件结合[12]，其生物学功能主要是激活或抑制这些靶基因表达[13]。因此一旦Egr-1基因与DNA结合，其相互作用可以表现为共激活或共抑制。

胰岛素在许多组织中包括肝脏、骨骼、胰腺β细胞及血管内皮组织细胞中均可调节Egr-1基因表达[14]。Sara等[1]首次使用体外模型 GN11 细胞系证明了Egr-1基因在胰岛素增加GnRH基因表达中起到重要作用。在GN11细胞系中，在使用胰岛素处理30 min后，Egr-1 mRNA水平显著提高;在处理60 min后，Egr-1蛋白和GnRH mRNA水平显著提高。其结论是胰岛素存在时，Egr-1基因与GnRH基因启动子的近侧区的富集鸟嘌呤与胞嘧啶区域即-75～-67 bp结合，改变GnRH基因启动子的活性，从而增加GnRH基因表达(图1)。GN11细胞系是一种永生的GnRH分泌型神经元细胞系。虽然在体外研究中无限增殖的细胞并不能代表体内的反应，但是在GnRH合成和释放的调节机制的研究中，这种永生的细胞系的价值已经被证实是有重要意义的[15-16]。

在体外细胞模型研究中，Kim等[17]首先证明了胰岛素在GnRH神经元细胞系中直接作用于GnRH神经元，促进GnRH基因表达。进一步研究发现胰岛素刺激丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)基因表达是胰岛素促进GnRH分泌的原因，但是胰岛素对MAPK基因的作用机理还不清楚[18]。有研究证明由胰岛素诱导的Egr-1基因表达首先是由MAPK激酶(MEK)途径介导的，在Egr-1基因转录时，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)和 p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)途径起到一个调整作用，但并不是本质的信号传导途径[19]。使用MAPK特异性抑制剂对细胞进行预处理之后，胰岛素诱导的Egr-1基因转录被完全抑制。相反，使用PI3K特异性抑制剂预处理后，由胰岛素诱导的Egr-1基因转录并没有明显变化[1]。因此确定，胰岛素诱导Egr-1基因转录是通过MAPK途径进行的。

图1 胰岛素通过Egr-1影响GnRH分泌过程Fig.1 The secretion of GnRH affected by Ins through Egr-1

2.2 胰岛素影响GnRH活性的ERK途径

ERK是MAPK的家族成员之一，ERK广泛存在于中枢神经系统，可对多种细胞外刺激发生反应，是将哺乳动物细胞外信号转导至胞内并激活一系列级联反应的关键物质。在中枢神经系统的研究中发现ERK可通过调节基因表达、蛋白质合成等影响神经细胞增殖分化及轴突生长，并参与多种神经系统疾病的病理生理过程[20]。小鼠垂体ERK1、ERK2基因双敲除后，雌性小鼠由于LH合成缺乏会导致排卵故障甚至不育，雄性小鼠表现轻微LH分泌不足，但对其繁殖力无明显的影响[21]。

LH是由α亚基和β亚基组成的异二聚体糖蛋白，其中β亚基决定其特异性[20]。下丘脑分泌的GnRH与脑垂体GnRH受体结合后，刺激促性腺激素LH和FSH的分泌。同时，GnRH在垂体促性腺物质细胞中还通过激活ERK诱导LHβ亚基和FSHβ亚基的基因表达[2]，促进二者生物合成，增加LH和FSH的合成。

在促性腺物质分泌细胞中，GnRH与位于细胞膜上的特定微区域即脂筏结构[22]上的受体结合，该受体对该脂筏结构有特殊亲和力[23]。GnRH与受体结合后，通过G蛋白 α亚基 q/11亚型(Gαq/11)即可激活磷脂酶 C(phospholipase C，PLC)。Gαq/11与配体结合后，构象发生改变，其 α亚基和γ、β亚基组成的二聚体从受体上分离出来。分离出的α亚基可以调整许多酶的效应器以及制造第2信使1，4，5-三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)和甘油二酯(DAG)[24]。α亚基使磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-diphosphate，PIP2)分解，产生 IP3和 DAG。IP3与内质网表面上的IP3受体结合直接诱导内质网中的Ca2+释放到胞质中，随着这个始发信号，更多的胞外Ca2+通过L型电压通道流入到胞内，使胞质中Ca2+浓度增加。DAG和磷脂协同作用，并且在Ca2+的参与下，激活多种亚型的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)。在垂体 αT3-1细胞中，PKC活化是GnRH激活ERK途径所必需的，但其作用机理还不清楚[25]。在垂体细胞中，Raf-1的作用是可活化ERK上游区。PKC可直接激活Raf-1，但是Raf-1在GnRH诱导ERK活性中的发挥作用尚不清楚。PKC激活后，使PKC途径下游细胞MAPK及 ERK活性增加[2]。其中 MEK和 ERK的蛋白质互作可以确定ERK信号作用的特异性[26]。ERK激活后可通过调节Egr-1基因的表达来促进 LHβ基因表达[27-28](图2)。

图2 胰岛素影响GnRH活性的ERK途径Fig.2 Ins affected GnRH activity through ERK pathway

ERK途径包括转导来自于大批不同细胞表面受体的信号途径，这些受体中最典型的是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)。胰岛素受体是RTKs亚科中的一员，因此可诱导ERK蛋白的激酶活性[21]。

胰岛素受体在全身各处均被表达，包括脑垂体[29]。结合胰岛素之后，胰岛素受体的β亚基就会刺激酪氨酸发生自身磷酸化作用，导致受体酪氨酸激酶活性增加。活化之后，胰岛素受体又使胞内许多底物包括胰岛素受体家族、GRB2相关结合 蛋 白 1(GRB2-associated-bindingprotein 1，Gab1)和Gαq/11磷酸化。这些底物磷酸化以后导致一些复杂的信号级联，包括 PI3K和 ERK[30]。在促性腺激素释放细胞系LβT2细胞中，胰岛素受体是LβT2细胞的脂筏微结构的基本成分，其作为膜蛋白对脂筏的选择性亲和力与GnRH受体的选择性亲和力一致[3]。并且在LβT2细胞系中，研究胰岛素受体和GnRH受体(GnRHR)在促性腺细胞中的串联作用机制时，发现ERK是GnRH和胰岛素信号所共用的靶目标，二者共用会增加ERK的兴奋性。胰岛素单独作用不能强烈激活ERK信号，但是ERK经过GnRH磷酸化作用后，胰岛素便有可能强烈激活ERK活性。并且二者之间的相互作用首先反映在由ERK活性定向调节控制的LHβ基因翻译上，而且最终使LHβ基因翻译活性增强[3]。因此，在垂体水平，胰岛素可通过调节ERK活性间接促进LH分泌。

2.3 胰岛素通过NPY神经元对GnRH活性的影响

神经肽Y是1982年从猪脑中分离出的一种多肽，含36个氨基酸，是胰多肽家族中的一员，其广泛分布在哺乳动物的中枢及外周神经系统中。位于下丘脑弓状核上的NPY神经元主要作用是刺激进食，调节能量平衡。NPY神经元在能量负平衡的条件下被激活，然后NPY释放增加刺激室旁核及视前区的感受器，诱导摄食[31]。有证据表明，与调整能量代谢有关的神经元能够与GnRH神经元相通，这些神经元在体内与下丘脑-垂体-性腺轴产生交互作用，即:在下丘脑内侧视前区，NPY纤维与GnRH神经元的树突和胞体密切相关，并且下丘脑正中隆起的NPY纤维可能也作用于GnRH的感受器[4]。因此，NPY神经元被认为是连接能量平衡与生殖及调节生殖轴活性的重要因子。当NPY增加并刺激摄食时，GnRH的释放及脑垂体、性腺的活性都会被抑制。支持这个假设的证据是:在NPY基因敲除的雌性小鼠中，禁食并不能引起LH分泌的抑制[32]。而且，缺乏 NPY的肥胖小鼠与正常肥胖小鼠相比，显示出较好的繁殖力[33]。研究表明，母猪在泌乳期间，NPY对GnRH的抑制作用会增强，在背内侧下丘脑处起抑制作用的NPY增强子直接作用于GnRH细胞体，通过突触后的NPY Y5受体去抑制GnRH神经元活动[34-35](图3)。

图3 NPY对GnRH的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of NPY on GnRH

但是，药理学证据却显示，在NPY调节GnRH脉冲发生器时存在2种机制，一种是抑制，另一种是刺激[4]。在大多数物种中，雌二醇和孕酮水平较低时，例如在未到青春期或卵巢切除的动物中，NPY对GnRH的水平、脉冲幅度和频率是抑制的。但是在多数动物中，类固醇水平升高后，就会将NPY的作用变为刺激作用[36]。并且，NPY的出现是GnRH激增所必需的。在动物发情前期，如果NPY免疫中和或Y1受体封闭，LH峰就会衰减。敲除NPY基因的雌性显示，其LH峰减少了70%。

在下丘脑弓状核内侧区域既存在NPY基因的表达也存在胰岛素受体的表达[4]。胰岛素会抑制下丘脑NPY基因表达。在禁食动物的脑室内注射胰岛素，结果弓状核的NPY mRNA下降，同时下丘脑室旁核的 NPY下降[37]。泌乳大鼠去卵巢后NPY基因表达水平会比对照组高，但用胰岛素处理48 h后，下丘脑弓状核NPY mRNA表达水平降低[5]。研究表明，NPY基因表达受胰岛素影响的同时，还受雌激素水平的调节。在下丘脑细胞系中，雌激素受体的比例(即ERα/ERβ)也调节NPY基因的表达，但是雌激素受体更偏向于抑制NPY基因。因此，在研究胰岛素对NPY的影响时，也要考虑雌激素水平对NPY的调节。

3 胰岛素调控GnRH在生产实践中的意义

营养因素不仅可以对下丘脑GnRH及垂体促性腺激素分泌进行直接调控，还能通过生长激素-胰岛素样生长因子-胰岛素轴间接进行调控。其中生长激素和胰岛素样生长因子的作用机制也是目前研究的热点。繁殖内分泌轴和代谢内分泌轴之间有着复杂的相互作用和相互干扰，这些作用机制还不是十分清楚。将这些理论用于生产实践中，对于迟迟不发情的后备母猪及断奶母猪可以进行催情补饲，饲喂碳水化合物特别是葡萄糖来促进其发情。饲料能量来源主要是淀粉和脂肪，而葡萄糖作为第3种能量来源，却很少被研究。大量研究通过调节淀粉和脂肪在饲料中添加的数量以及比例来缩短后备母猪初情期。如后备母猪以淀粉为主要能量与以脂肪为主要能量相比，能够提高胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素浓度和促进LH分泌，提高后备母猪卵泡发育及提高排卵率[38]，提高初情静立率，缩短发情周期[39]。

增加葡萄糖摄入可直接导致体内胰岛素水平增加，不仅对GnRH产生一系列影响，而且胰岛素还促进卵巢发育和提高优势卵泡的数量，这些都能提高母猪生产力[40]。如在后备母猪饲粮中每日添加60 g葡萄糖，在第2情期配种，配种日龄216日龄，体重123.5 kg，交配率92%，得到产活仔数10.76头，窝产总重16.71 kg，断奶总重60.03 kg的良好繁殖性能[41]。每日在断奶母猪饲粮中添加150 g葡萄糖，可提高窝内仔猪初生重均一度[42]。

研究表明，胰岛素可能会保持和促进排卵期之前卵巢上卵泡的发育能力，防止其退化和闭锁，增加可能发育到排卵阶段的卵泡数量。因此，研究主要以葡萄糖为饲料来源，增加动物体内胰岛素水平与动物发情之间的关系非常重要。利用多种营养调控手段来最终实现缩短母猪初情期和间情期，是未来研究饲料能量来源的重要课题。

4 小结

胰岛素是动物体内调节糖代谢的重要激素，代表着动物体内能量代谢水平。GnRH是动物启动发情的起始因素，是调控动物生殖的重要激素。随着对胰岛素和GnRH相互作用的深入研究，人们对机体能量平衡与生殖活动之间的作用机制已经有了较深的认识。胰岛素调节GnRH活性和功能过程中Egr-1、ERK和NPY均发挥重要作用，但是否还存在其他作用途径有待于进一步研究。全面理解能量平衡与动物繁殖之间的复杂的作用关系，通过营养调控来调节胰岛素的分泌，促进动物发情，是实现动物发情调控的有益探索。

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