一株聚己内酯降解真菌的筛选、鉴定及降解特性研究

陈 珊，林秀梅，李 凡，刘东波，夏红梅

(东北师范大学 生命科学学院，吉林 长春 130024)

0 引言

从上世纪60年代开始，塑料以其质轻、价廉、易加工成型等优势受到了人们的青睐，与钢铁、木材、水泥并列成为材料领域的四大支柱，被应用于社会生活的各个方面。但是传统塑料固有的不可降解性使其在环境中大量堆积，已经对地球造成了严重的污染和巨大的威胁[1]。近年来，为了解决环境危机问题，可生物降解材料及相关研究受到了关注，聚羟基丁酸酯(PHB)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚琥珀酸丁酸酯(PBS)等高分子聚合物作为可生物降解材料已经被成功地应用于包装、农业、医药及其它领域。PCL由ε-己内酯在金属有机化合物(如四苯基锡)做催化剂，二羟基或三羟基做引发剂条件下开环聚合而成，属于聚合型聚酯。它具有较好的生物相容性、生物降解性、溶剂溶解性，以及高结晶性和低熔点性，这些优良的性质使PCL可以成为传统塑料的有效替代物；另外该聚合物安全无毒，在生物医用材料、环境友好型塑料、生态纤维等领域有着广泛的应用前景[2]。

据报道，PCL在微生物的作用下可被完全分解成CO2和H2O，在自然条件下，该材料一年可降解约95%[3]。研究发现一些降解脂肪或角质的微生物对PCL具有降解作用[4]，也证明了这种作用是由微生物分泌的PCL解聚酶引起的，但具体的降解机制尚未阐明。本文从土壤中筛选出的一株可降解PCL的真菌DSYD05，并对该菌株进行了菌种鉴定及降解特性的研究，为进一步研究PCL的微生物降解机理奠定了基础。

1 材料和方法

1)菌株的筛选。采集多地活性污泥，打散后的上清液进行梯度稀释，涂布于以PCL为唯一碳源的平板上28℃恒温培养，选取菌落周围有明显透明圈的菌株进行进一步的研究。

2)培养基(W/V)。察氏培养基：NaNO3，0.3%；KH2PO4，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；KCl，0.05%；FeSO4，0.001%；蔗糖，3%；琼脂，1%；自然pH。PCL乳化培养基：PCL，0.1%；Na2HPO4·12H2O，1.194%；KH2PO4，0.554%；NH4Cl，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；CaCl2·2H2O，0.0005%；pH为6.8。

3)PCL乳化液的制备。将0.1g PCL颗粒溶于10mL氯仿中，加入0.04g Plysurf A210G乳化液搅拌均匀后与100mL培养基或缓冲液混合，超声破碎约10min，将所得悬浮液75℃处理90min去除氯仿，用蒸馏水定容至100mL。

4)粗酶液的制备。将孢子悬液接入PCL乳化培养基中，一定条件下培养，将发酵液于4℃，12,000rpm离心20min，所获得上清液为粗酶液。

5)酶活力的测定。用磷酸缓冲液(pH 6.0)制备PCL乳化液作为酶活力检测的底物。取3mLPCL乳化液置于40℃的恒温水浴锅中预热10min后，加入1mL粗酶液，保温一定时间后，测定650nm处光吸收值(降低值)，以灭活的粗酶液作空白对照。一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收值降低 0.001(A650nm)单位所需的酶量[5]。

6)菌株的形态学鉴定。通过插片培养法、点植培养法观察菌落形态，在显微镜下观察菌丝体大小、形状、表面特征及是否有横隔、类型、颜色、形状、孢子大小等，对照《真菌鉴定手册》[6]进行初步判断。

7)菌株的分子生物学鉴定及进化分析。以菌株基因组DNA为模板进行ITS序列扩增及分析，基因组DNA提取方法参考分子生物学实验方法[7]。所用扩增引物为正向引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，反向引物ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，连接至PMD18-T载体送上海生工公司测序。将测得的基因序列进行NCBI Blast分析，并采用MEGA4.0软件构建系统发育树。

8)发酵温度对菌株产酶的影响。将孢子悬液接入到PCL乳化液培养基中，分别置于20℃、25℃、28℃、37℃和42℃摇床中培养。间隔24h取样，测定粗酶液的PCL降解活力，研究不同发酵温度对菌株产PCL解聚酶的影响。

9)PCL含量对菌株产酶的影响。配制PCL含量分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%的乳化培养基，接种后在测得的最适发酵温度下培养。间隔24h取样，测定粗酶液的PCL降解活力，研究不同PCL含量对菌株产PCL解聚酶的影响。

10)培养基初始pH对菌株产酶的影响。制备最适含碳量的PCL乳化培养基，初始pH值分别调至5、6、7、8和9，接种后在测得的最适发酵温度下培养。间隔24h取样，测定粗酶液的PCL降解活力，研究培养基不同初始pH对菌株产PCL解聚酶的影响。

11)装液量对菌株产酶的影响。将PCL乳化液培养基分别按装液量为25、50、75、100和125mL分装至250mL的三角瓶中，接种后置于最适发酵温度下培养。间隔24h取样，测定粗酶液的PCL降解活力，研究不同通气量对菌株产PCL解聚酶的影响。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选

采用透明圈法从多个土样中成功筛选到5株可降解PCL的真菌，对这5株真菌进行液体培养后，依次测定了各菌株降解PCL的能力，其中菌株DSYD05具有最高的PCL降解能力，因此选择该菌株进行进一步的研究。

2.2 菌种的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

菌株DSYD05在28℃培养3d后，菌落直径约为36mm，气生菌丝为絮状，紧贴培养基生长，菌落生长致密，表面平坦，边缘光滑整齐，具有霉味。菌落最外缘为白色，向中心依次呈绿色、墨绿色、灰绿色，灰绿色为分生孢子(图1)。背面颜色由外向内从白色逐渐变成暗黄色(图2)。

显微镜下观察可见气生菌丝呈绒状，显白色，一般较长，具有横隔，壁光滑(图3)。分生孢子梗为帚状枝，对称或不对称分支。瓶梗为柱形细胞。分生孢子多，呈灰绿色，椭圆形，壁光滑，分生孢子链纠缠在一起，分生孢子数一至多个不等(图4)。

图1 菌落正面生长状况 图2 菌落背面生长状况

图3 菌株DSYD05菌丝体形态 图4 菌株DSYD05的帚状枝结构

根据菌株的菌落特征及菌丝体和孢子的形态特征，参照《真菌鉴定手册》，认为该菌株属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢真菌纲Hyphomycetes，丝孢菌目Hyphomycetales，丛梗孢科Moniliaceae，青霉属Penicillium。

2.2.2 分子生物学鉴定

在形态学观察的同时对菌株进行了分子生物学鉴定。测定该菌株的ITS序列在GenBank数据库中进行Blast同源序列比对。比对结果与青霉属的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的序列一致度为100﹪。将相关序列通过Clustal X软件进行多序列比对之后，利用软件MEGA4.0绘制系统发育树(图5)。菌株DSYD05在系统树中与Penicilliumoxalicum属于同一分支。结合形态学鉴定结果，确定该菌为青霉属Penicilliumsp.的草酸青霉Penicilliumoxalicum。

2.3 Penicillium oxalicum DSYD05降解特性的研究

2.3.1 发酵温度对菌株产酶的影响

将孢子悬液接种到PCL乳化液培养基中，分别置于不同温度下震荡培养，绘制Penicillium oxalicum DSYD05在不同发酵温度条件下的产酶曲线，结果如图6所示。由图可知，在不同温度下培养，菌株的产酶曲线随培养时间的延长均出现先上升后下降的趋势。由于菌株在不同温度下的生长状态不同，因此其达到产酶高峰的时间也不相同， 28℃时菌株产酶酶活力达到最高，随着温度的继续升高，不利于菌株的生长及产酶，到达产酶高峰时间有所延长，酶活力开始下降。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05菌株产PCL解聚酶的最适发酵温度为28℃。

图5 DSYD05菌株ITS序列的系统发育树

图6不同培养温度下PenicilliumoxalicumDSYD05的产酶曲线

2.3.2 PCL含量对菌株产酶的影响

将孢子悬液分别接种到PCL含量(w/v)分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%的乳化液培养基中，28℃下震荡培养，绘制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同PCL含量条件下的产酶曲线(图7)。由图可知，在各PCL含量下菌株产酶

示Lh学产酶 高峰均出现在第5天，培养基中PCL含量为0.2%时，PenicilliumoxalicumDSYD05产PCL解聚酶的量最大，低于或高于该浓度，粗酶液的PCL解聚酶活力均出现下降。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05菌株产PCL解聚酶的最适培养基碳源含量为0.2%。

2.3.3 发酵初始pH值对菌株产酶的影响

制备PCL含量为0.2%的乳化培养基，调整培养基初始pH分别为5、6、7、8和9，接入孢子悬液后于28℃下震荡培养，绘制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同初始发酵pH条件下的产酶曲线(图8)。由图可知，初始发酵pH对菌株产酶影响明显，在5-7范围内，随着初始pH的升高，PCL解聚酶活力增强，pH为7时，DSYD05产PCL解聚酶活力达到最大，随着pH的继续增大，产酶高峰出现滞后，酶活力降低，可能是由于菌株要适应不良环境而导致生长相对缓慢。在以往报道中，真菌的最适生长和产酶pH一般为中性偏酸，但在本实验中培养基初始pH为中性时，菌株DSYD05产酶最好，同时在初始发酵pH为偏碱性时菌种仍然具有较好的产酶能力，这可能是因为PCL在降解的过程中会生成酸性的中间产物，造成培养基pH的降低，因此初始的发酵pH稍高更适合菌株的后续生长和产酶。由此实验结果可以得出PenicilliumoxalicumDSYD05菌株产PCL解聚酶的最适发酵初始pH为7。

2.3.4 不同装液量对菌株产酶的影响

制备PCL含量为0.2%的乳化培养基，调整培养基初始pH为7，分别按装液量为25、50、75、100、125mL分装至250mL的三角瓶中，接入孢子悬液后于28℃下震荡培养，绘制PenicilliumoxalicumDSYD05在不同装液量条件下的产酶曲线，结果如图9所示。由图可知，当装液量为25mL时，摇瓶的通气量最好，适宜菌体的生长，使PenicilliumoxalicumDSYD05的产酶高峰出现较早(第4d)，但此时的酶活力并不是最高，可能与营养物质有限限制了菌体的生长和产酶有关。随着装液量的增加，菌株到达产酶高峰时间有所延长，当装液量为50mL时，菌株产酶酶活力达到最高，继续增加装液量时，发酵体系中的溶氧量也随之下降，不利于菌株的生长，酶活力也呈下降趋。因此，PenicilliumoxalicumDSYD05产PCL解聚酶的最适装液量为50mL。

3 结语

本文采用唯一碳源法从活性污泥中筛选了一株对PCL具有降解活性的真菌，根据菌株的形态学观察和分子生物学分析，鉴定该菌株为草酸青霉Penicillium oxalicum。采用摇床液体培养的方法，对Penicillium oxalicum DSYD05产PCL解聚酶的发酵条件进行了优化研究，实验结果显示，在28℃、PCL含量0.2%、培养基初始pH值为7、装液量50mL，培养5d时Penicillium oxalicum DSYD05产PCL解聚酶量可达到最高值。在各条件中，培养温度和培养基初始pH值对菌株的产酶量影响较大。为了进一步研究菌株对PCL的微生物降解机制，下一步工作将该对菌株产生的PCL解聚酶进行分离纯化和催化特性的研究。

[参考文献]

[1] Y.Tokiwa, B.P. Calabia, C.U. Ugwu et al. Biodegradability of Plastics[J]. Int. J. Mol. Sci. 2009(10):3722-3742.

[2] 刘立建. 聚己内酯的合成与应用研究[C]．上海：第二届中国国际生物降解塑料应用研讨会，2010.

[3] 江涛，吴丽霞.包装材料的发展及生态化研究[J]．中国包装，2004(5):53-55.

[4] V.K. Khatiwala, N Shekhar, S Aggarwal et al. Biodegradation of Poly(e-caprolactone) (PCL) Film by Alcaligenes faecalis[J]. J Polym Environ,2008,16:61-67.

[5] 陈珊，郭子琦，李凡等.P(3-co-4)HB解聚酶的分离纯化及酶学性质研究[J].大庆师范学院学报，2011，3l(6)：96-100.

[6] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]．上海：上海科技出版社，1979.

[7] F.M.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，等. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京：科学出版社，2008.