大庆油田聚驱后油藏细菌群落演替规律研究

张 虹,任国领,曲丽娜,丁海燕,张 莹,黄永红

(大庆师范学院 生命科学学院， 黑龙江 大庆 163712)

0 引言

聚合物驱油技术对大庆油田提高原油采收率起到了极其重要的作用[1]。但是，聚驱后油藏如何提高原油采收率已经成为困扰大庆油田发展的问题之一。耗资少、能源消耗少、投入产出高、直接利用微生物菌种和对环境无污染的微生物采油技术(Microbial enhanced oil recovery, MEOR) 已成为石油开采技术的研究热点。目前，微生物采油技术在大庆油田已经进入矿场实验阶段，但该技术仍存在一些关键性问题尚未解决，即对微生物采油过程中菌群结构演替规律分析不够[2]。基于16S rDNA基因的微生物分子生态学技术，研究油藏环境中的微生物突破传统培养方法认知和研究微生物的局限性，应用微生物分子生态学方法研究油藏微生物群落结构的报道也日益增多[3]。Huang等[4]利用构建16S rDNA克隆文库的方法，研究大庆油田低渗透油藏微生物群落结构和种群多样性；Orphan V J等[5]建立16S rDNA 克隆文库与富集培养相结合的方法，研究加利福尼亚某高温油藏中微生物的多样性；She YH等[6]利用PCR-DGGE技术分析了新疆克拉玛依油田一中区原油储层微生物群落结构及种群多样性。

采用PCR-DGGE实验技术，分析大庆油田聚驱后油藏北-2-4-P49油井微生物调剖不同时期细菌群落结构和优势种群变化规律，以及主要的采油功能菌，为大庆油田聚驱后油藏微生物采油技术现场试验提供基础资料和技术指导。

1 材料和方法

1.1 样品来源和油藏特征

北-2-4-P49油井位于大庆油田北二西西块聚合物驱后区块，砂岩厚度、有效厚度、地层系数、静压分别为24.6m、15.7m、15.57、12.13 MPa。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集及微生物群落基因组总DNA的提取

样品采集和基因组DNA的提取按文献[7]进行，基因组储存在-20℃备用。

1.2.2 PCR-DGGE

PCR扩增：从油藏微生物基因组DNA扩增用于DGGE的16S rDNA引物为大多数细菌16S rDNA通用引物为BSF338/BSR534[8]，扩增产物片段长约为200 bp。PCR扩增反应体系[9]: 1.5 μL 模板，12.5 μL Premix Taq VERSION，0.75 μL 正向引物(25 mmol/L)，0.75 μL反向引物 (25 mmol/μL)和适量超纯水(补足25 μL)。PCR扩增反应条件：95 ℃，预变性5 min，循环过程为：94 ℃,1 min ,30 s；54 ℃,1 min,30 s；72 ℃,45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用TaKaRa凝胶回收和纯化试剂盒进行回收和纯化。

DGGE分析：DGGE电泳按照Bio-Rad基因突变检测仪说明进行。电泳后对目的片段进行银染、切胶和回收，连接到pMD-19T载体进行克隆子16S rDNA序列测序，测序由北京天一辉远生物技术公司完成。寻找最相似的已知序列及最相似的已知分类地位的序列方法按文献[8]进行。用MEGA4对归为同一OUT的16S rDNA基因序列及它们在GenBank中的最相似序列构建邻接进化树(Neighbor-joining tree)[10]，进行进化分析。

2 结果与讨论

2.1 基因组的提取和16S rDNA的扩增

首先，提取微生物调剖前、中、后时期样品的细菌基因组，如图1A所示，得到的基因组条带清晰，明亮，可用于后续的实验。然后，用大多数细菌16S rDNA 通用引物BSF338/BSR534扩增用于PCR-DGGE的16S rDNA基因，如图1B所示，我们得到的16S rDNA 基因PCR产物条带清晰、特异性高。扩增产物经琼脂糖回收和纯化试剂盒进行回收和纯化。

图1 基因组的提取和16S rDNA的扩增 A) 细菌基因组, B) 16S rDNA基因的PCR扩增1、2、3分别代表微生物调剖前、中、后期

2.2 DGGE电泳和分析

2.2.1 DGGE电泳

16S rDNA扩增后，对微生物调剖前、中、后期的细菌16S rDNA扩增产物进行DGGE电泳。如图2所示，微生物调剖不同时期，优势条带明显，并且，优势条带有一些明显的变化。微生物调剖过程中，p7、p10、p20条带有明显增强趋势。这些结果初步表明，北-2-4-P49油井在微生物调剖过程中细菌多样性丰富，细菌群落结构变化明显。

图2 细菌16S rDNA V3～V6 区PCR-DGGE 图谱, 1、2、3分别代表微生物调剖前、中、后期

2.2.2 DGGE分析

对优势条带进行切胶、克隆，克隆子测序结果经过拼接处理后，以FASTA格式在GenBank数据库中进行BLAST比对分析(见表1)，并对它们及其在GenBank中的最相似序列构建系统发育树。结果显示，微生物调剖早期优势细菌菌群主要包括假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和一些未培养细菌；微生物调剖中期优势细菌菌属主要包括不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、厚壁菌属(Firmicutes bacterium)、和一些未培养细菌；微生物调剖后期优势细菌菌属主要包括不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、厚壁菌属(Firmicutes bacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和一些未培养细菌。微生物调剖过程中，有明显增强趋势条带p7、p10、p20分别代表的是厚壁菌属(Firmicutes bacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。这一结果与Ren GL[4]在大庆油田的研究结果以及国内其它油田[11-13]的研究结果较一致。结果显示，作为主要微生物采油菌它们在大庆油田微生物调剖过程中可以起到降解烷烃、降解聚丙烯酰胺、脱硫、脱氮和产生表面活性剂降低稠油黏度的作用[14-15]。

3 结语

应用分子生态学技术，研究了大庆油田聚驱后油藏北-2-4-P49油井微生物调剖过程中细菌群落结构演替规律。细菌微生物基因组大小约为23kp，用于DGGE的16S rDNA的PCR扩增条带大小约为200bp，DGGE实验条带丰富、清晰、易于后续操作。

微生物调剖过程中，细菌微生物多样性丰富，优势条带明显，优势细菌菌群变化较大。早期优势细菌菌群主要是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和一些未培养细菌；中期优势细菌菌属主要是不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、厚壁菌属(Firmicutes bacterium)和一些未培养细菌；后期优势细菌菌属主要是不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、厚壁菌属(Firmicutes bacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和一些未培养细菌。微生物调剖过程中，厚壁菌属(Firmicutes bacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)有明显增加的趋势。

对微生物调剖过程中细菌群落结构演替规律的研究可以为微生物采油过程提供技术指导和实际参考。

表1 微生物调剖过程细菌16S rDNA的PCR-DGGE优势种群分析

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