新加达原饮体外抗HBV的实验研究

王礼凤，李长秦，冯海杲，郑旭锐，曹宁

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046;2.汾阳市中医学会，山西 汾阳 032200)

乙型肝炎是由HBV引起的，以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。目前公认的抗病毒治疗药物主要是干扰素及核苷类等，但其疗效均不理想。新加达原饮(Influence of XinjiaDaYuanYin，IXJDY)是在我国明代著名医家吴又可创立的达原饮的基础上，经过长期临床实践加减变化组成的、对慢性乙型肝炎具有较好治疗效果的经验方，本实验以转染HBV DNA全基因HepG2.2.15细胞株为对象，研究新加达原饮体外抗HBV的效果。

1 材料

HepG 2.2.15细胞株购自上海佛雷堡生物发展公司;新加达原饮药液由陕西中医学院药学院制取。

HBsAg和HBeAg酶联免疫检测试剂盒(西安永屹生物发展有限公司，批号CK－E10545H);1640培养基(Gibico公司，批号3856);胎牛血清(Hyclone公司，批号20060404);G418(美国Sigma公司，批号108321－42);0.25%胰酶(Trypsin，Gibco公司，批号 0527);拉米夫定(lamivudine，3TC，葛兰素史克制药有限公司，批号09030037);四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)，二甲基亚砜(美国Sigma公司)。

2 方法

2.1 IXJDY含药培养液的配制 将新加达原饮药物加入1 000ml水煎煮40min，第2次加入500ml水煎煮0.5h，合并煎液，滤过后得水煎液500ml;将煎好的药液冷却浓缩至每毫升含生药1g，然后醇沉使其体积分数达到80%，即用900ml乙醇静置24h后取上混悬液离心，然后将乙醇回收并定容至350ml备用，然后在超净工作台先用0.45μm的微孔滤膜过滤，再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装于无菌的玻璃瓶中保存于4℃冰箱中备用。实验时用完全培养液将IXJDY稀释成所需终浓度的应用液。

2.2 IXJDY的细胞毒性实验

根据Mosmann建立的四甲基噻唑蓝(MTT法)比色法检测药物对细胞的毒性作用。将2×104个/mL的细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μL，置CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入用完全培养液将IXJDY系列5 倍稀释成200，40，8，1.6，0.32mg/mL 的应用液100μL，每个质量浓度设6个复孔。连续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT 10μL，于CO2孵箱中继续培养。4h后小心吸弃上清液后，每孔加DMSO 100μL，微量振荡器振荡5min，使结晶紫完全溶解。自动酶标仪(检测波长570nm，参考波长630nm)读取各孔OD值，记录结果。按Reed－Muench法计算半数细胞毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。TC50=Antilog［B+(50－B)/(A －B)×C］，A=log＞50%药物浓度，B=log＜50%药物浓度，C=log释稀倍数。

2.3 IXJDY 对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBV DNA 的影响

将2×104个/mL的细胞悬液加入24孔细胞培养板，每孔1mL，置 CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，根据细胞毒性试验结果，分别加入最大无毒浓度以下系列2倍稀释成5个终质量浓度的应用液:8(A组)、4(B组)、2(C 组)、1(D 组)、0.5(E 组)mg/mL，每个质量浓度设3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照，以证实有效的拉米夫定(3TC，0.1mg/mL)为阳性对照药。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5mL灭菌Eppendorf管中，－20℃保存，统一待检。再次加入上述含不同浓度药物的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5mL灭菌Eppendorf管中，－20℃保存，统一待检。

将装有上清液的冷藏管进行逐一排序标号，用离心机分离，然后移入生物安全柜，从每个离心好的冷藏管中取40ul上清液加入离心管中，然后在每个离心管中加入40μl的DNA提取液，置于漩涡混合器振荡混匀5s，取出样品放置于100℃恒温加热金属仪，煮10min，冷确后移入离心机12 000r/min离心5min后将离心管取出，送到生物安全柜，从每个管中吸取上清液2μl加入DNA反应管，将反应管盖好置于离心机离心20s，使上清液在 PCR管中穿过蜡层与反应管中的HBV－PCR反应液Taq酶系充分结合，上机检测结果并记录数据。

2.4 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理，结果以(±s)表示，两组间比较采用成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 IXJDY 对 HepG2.2.15 细胞毒性

按照Reed－Muench法计算得出:TC0=8.13mg/mL，TC50=14.22mg/mL，即当药物浓度≤TC0时，HepG2.2.15细胞无论在形态上还是数量上与空白对照组比较没有发生明显变化。结果提示，IXJDY对HepG2.2.15 细胞毒性较低，见表 1。

表1 新加达原饮对HepG2.2.15细胞毒性的毒性作用(±s，n=6)

表1 新加达原饮对HepG2.2.15细胞毒性的毒性作用(±s，n=6)

组别 终浓度(mg/mL) OD值 细胞存活率(%)空白对照组 —0.683 ±0.085新加达原饮1 组 200 0.154 ±0.045 22.5新加达原饮2 组 40 0.32 ±0.036 46.9新加达原饮3 组 8 0.649 ±0.083 95.3新加达原饮4 组 1.6 0.665 ±0.078 97.4新加达原饮5组0.32 0.677 ±0.143 99.1

表2 新加达原饮对HepG2.2.15分泌 HBV DNA的抑制作用(±s，n=3)

表2 新加达原饮对HepG2.2.15分泌 HBV DNA的抑制作用(±s，n=3)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

72h 144h(%) 拷贝数 抑制率(%)空白组组别 药物浓度(mg/mL)拷贝数 抑制率7.560 ±0.578 7.226 ±0.576 3TC 0.1 4.677 ±0.319* 38.1 3.405 ±0.535＊＊ 52.9 A 组 8 3.924 ±0.192＊＊48.1 2.168 ±0.619＊＊ 70.1 B 组 4 4.138 ±0.481＊＊45.3 2.416 ±0.142＊＊ 66.6 C 组 2 4.251 ±0.593＊＊44.1 2.903 ±0.196＊＊ 59.8 D 组 1 4.652 ±1.115* 38.5 3.384 ±0.965＊＊ 53.2 E 组 0.5 5.213 ±0.851* 31.1 4.103 ±1.164＊＊43.2

3.2 IXJDY 对 HepG2.2.15 细胞上清液中 HBV DNA的抑制作用

阳性对照药物3TC和IXJDY在最大无毒浓度下作用 72h，144h后，对 HepG 2.2.15 细胞分泌 HBV DNA均有一定抑制作用，与空白组比较，有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现较明显的量效和时效反应关系，见表2。

4 讨论

乙型肝炎是由HBV感染所引起的慢性肝脏炎症性病变，发病率高，目前抗病毒药物很难彻底清除病毒，长期迁延不愈，部分患者将转化为肝硬化、肝癌，或者病情恶化发生肝衰竭，最终引起死亡，严重影响人类健康。中医学认为，乙肝病毒属外感邪气，从其致病特征分析将其归纳为湿热疫毒之邪，本病的产生与肝胆脾胃脏腑关系密切，因脾为湿土之脏，易受湿热所犯，湿热困脾，不能运化水谷，日久湿邪停滞、精微不化，气虚湿盛;湿热中阻，熏蒸肝胆，肝失疏泄，横逆犯脾，脾气益伤;湿热疫毒胶着难解，以致肝胆脾胃互相影响，是导致乙型肝炎慢性化，临床治疗难以速效的根本原因。本实验所用新加达原饮，是以《温疫论》中达原饮为基本方，在多年临床实践的基础上不断筛选优化而成，也曾以消毒丹、消毒饮为名进行过临床观察。《温疫论》达原饮由草果、苍术、槟榔、黄芩、白芍组成，具有开达膜原，辟秽化浊之功效，是治疗湿热疫毒之邪留滞膜原的证候。新加达原饮在达原饮中加入叶下珠、厚朴、柴胡、丹参、姜黄、僵蚕、灵芝、甘草、蝉蜕，全方重用叶下珠、苍术为君，其中叶下珠清热解毒，苍术燥湿健脾，两药相伍清热祛湿各擅其长。以黄芩、厚朴、槟榔为臣，黄芩清热燥湿泻火解毒，厚朴行气燥湿，槟榔行气利水，三味药相互协同加强祛湿清热之功。柴胡与白芍配伍柴胡疏肝理气，白芍柔肝敛阴，既能养肝体，又能助肝用，姜黄、僵蚕、蝉蜕活血化瘀，理气通络，灵芝既可扶正祛邪，又可防止邪气内传。方中僵蚕能升阳中之阳气，姜黄、槟榔降阴中之浊阴，一升一降，内通外和，而杂气之流毒顿消;用柴胡配伍姜黄，一升一降加强气机舒畅的功能;诸药配合可使气机通畅，湿热清除，气血调和。故本方意在清热利湿解毒，疏肝理气活血。圆机活法，方证对应，临床用于治疗慢性乙型肝炎取得较好疗效［1－2］。

实验所用 HepG2.2.15 细胞模型是 Sells等人［3］在1987年将克隆的个头尾相连的HBV DNA全基因及抗G418质粒直接导入受体细胞—人肝癌细胞株HepG2细胞构建而成。该细胞不仅支持HBV DNA的复制，且支持Dane样颗粒的包装与分泌［4］，是目前国内外学者公认且广泛用于抗HBV药物筛选和评价等研究的模型。应用HepG2.2.15细胞证实中药在体外的抗乙肝病毒作用的研究屡见不鲜，从1982年Thyagarajan 等［5］首次利用 HepG2.2.15 模型证实了苦味叶下珠的体外抗病毒作用，单味中药、中药单体化合物及有效成分抗HBV活性的研究越来越受到重视。中药复方制剂虽然临床疗效显著，但因其成分复杂，普通的制取工艺难以清除杂质等，通过细胞学研究其抗HBV还比较少。本实验观察到，新加达原饮具有较好地体外抗HBV的效果，为临床应用提供了依据，同时也证实本方组方的思路符合慢性乙型肝炎的发病机制。

为了排除药物非特异性细胞毒性作用造成细胞死亡而影响实验数据，本实验通过醇水双提工艺制取药液，尽量减少中药复方杂质对细胞活性的影响，并采用MTT法观察了IXJDY对HepG2.2.15细胞的毒性作用，结果表明，TC50=14.22mg/mL，TC0=8.1mg/mL，提示IXJDY在8.0mg/mL以下浓度对HepG2.2.15细胞是无毒的，可以以此浓度作为实验的起始药物浓度。实验表明，新加达原饮在体外具有较好的抗HBV作用，与临床应用所反映出的疗效一致，但其确切的作用机制，还有待进一步研究证实。

［1］李长秦，刘国强，杜卫星，等.柴胡甘露饮治疗慢性乙型肝炎193例［J］.吉林中医药，2003，23(8):12 －13.

［2］李长秦，郝明霞，刘国强，等.加味消毒丹治疗慢性肝炎停药后远期临床疗效随防［J］.陕西中医学院学报，2007，30(1):17 －18.

［3］Sells MA，Chen ML，Acs G.Production ofhepatitisB virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitisB virusDNA［J］.Proc-NatlAcad SciUSA，1987，84(4):1005 －1009.

［4］Sells MA，Zelent AZ，Shvartsman M，et al.Replicative intermediates of hepatitisB virus inHepG2 cells thatproduce infectiousvirions［J］.JVirol，1988，62(8):2836 －2844.

［5］Thyagarajan SP，Thiruneelakantan K，Subramanian S，et al.Invitroinactivation of HbsAg by Ecliptaalba Hasskand Phyllan－thusniruri Linn［J］.Indian J Med Res，1982，76(Suppl):124－130.