金电极自组装基因分子膜的制备及电化学检测

黎媛萍 ，曾光明 ，汤 琳 ，陈耀宁 ，章 毅 ，刘 灿 ，李 贞 ，庞 娅

(1. 湖南大学 环境科学与工程学院，长沙 410082；2. 湖南城市学院 化学与环境工程学院，益阳 413000；3. 湖南大学 环境生物与控制教育部重点实验室，长沙 410082)

电极修饰是电化学检测过程中的关键步骤，自组装膜修饰电极是基于分子的自组装作用，在固体表面自然形成高度有序的单分子层膜[1-2]，在电极修饰的研究中备受关注。制备修饰电极的基因分子膜，一般是利用带巯基(—SH)的化合物在金电极表面上形成自组装单分子膜的特性来固定核酸基因[3-4]，形成的膜表面结构高度有序，稳定性好，有利于杂交检测，并获得环境目标样品中的相关生物信息。

目前，利用白腐菌对木质素进行生物降解已成为环境领域的研究热点，黄孢原毛平革菌是白腐菌中的代表菌株，具有较强的降解木质素能力。它所产生的木素过氧化物酶在木质素的分解中起着关键作用[5-6]，对其编码基因的快速准确检测有利于深入了解降解过程。用于杂交识别的自组装基因膜修饰电极电化学检测方法可实现对木素过氧化物编码基因的快速检测，操作简便，具有较好的应用前景。

本文作者利用巯基和金电极之间的化学键作用，将巯基修饰的单链基因探针自组装于金电极表面制备了捕获探针修饰金电极；将黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶编码基因作为检测的目标基因，使用生物素标记信号探针，两者竞争与捕获探针杂交。采用了差分脉冲伏安法、循环伏安法、交流阻抗法和电流—时间曲线法等一系列电化学分析方法[7-8]，通过自组装时间和信号探针最佳响应浓度的优化，目标基因的线性检测范围的确定，以及修饰电极的再生性能研究，最终建立了该自组装基因分子膜修饰金电极用于检测黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶编码基因的分析方法，以期用于木质素生物降解过程中基因的快速痕量检测。

1 实验

1.1 实验仪器

CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)，其三电极系统如下：d0.5 mm的自制金电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝为对电极。

1.2 实验材料

磷酸缓冲溶液 PB(Na2HPO4，1/15 mol/L；KH2PO4，1/15 mol/L；pH=6.98及7.38)。DNA杂交液：2×SSC缓冲溶液(0.3 mol/L NaCl，0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O，pH=8.0)。电极浸洗液：Tris-Cl缓冲溶液(0.1 mol/L三羟基氨基甲烷(Tris)，0.1 mol/L HCl，pH=8.0)。Piranha溶液：V(98% H2SO4):V(30% H2O2)=3:1(体积比)；0.5 mol/L H2SO4溶液；5 mmol/L Fe(CN)63-/Fe(CN)64-(铁氰化钾溶液)，0.1 mol/L KCl溶液，1 mmol/L巯基己醇(MCH)，1 mmol/L对苯二酚，0.5 mmol/L H2O2。所有试剂均为分析纯或优级纯试剂，所有溶液均用超纯水配制。HRP-SA溶液由PB(pH=6.98)稀释配制。

本研究所用低聚核苷酸序列为自行设计[9]，采用Clustal X对NCBI Gene Bank中黄孢原毛平格菌的10个lip序列进行了比对，然后用Primer Premier 5.0设计了捕获探针、目标基因和信号探针，由上海生工生物技术有限公司合成。捕获探针S1(5’→3’：HS-(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA)含有 20个碱基，5’端 用(CH2)6-SH 修 饰 。 信 号 探 针 S2(5’→3’：TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-Biotin)和目标基因S3(5’→3’： TGGCAGTCCTTCGTCAACAA)也含有 20个碱基，均能和捕获探针互补杂交，前者5’端用生物素修饰。辣根过氧化物酶标记链亲和素(HRP-SA)购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 金电极的制备

采用自制金电极(d0.5 mm)作为工作电极[10]。截取长度为1.5 cm的d0.5 mm金丝(纯度＞99.99%)，在其末端缠绕10 cm长的铜丝。截取长度为5 cm、内径为2 mm的干燥洁净热熔玻璃管，将其一端置于酒精喷灯火焰的外焰上灼烧，当尖端玻璃在高温下熔融呈水滴状时，迅速将末端缠绕有铜丝的金丝插入其中，使熔融态的玻璃包裹住金丝。灼烧过程中需不断转动玻璃管使其受热均匀，确保金丝和玻璃间不会形成气泡。灼烧完成后，离开火焰的瞬间，迅速将灼烧过的玻璃管倒置，熔融态的玻璃因重力作用缓慢向下流并冷却，保证金丝被玻璃紧密包裹。将初步制成的电极在 0～6号金相纱纸上依次画圈打磨，直至裸露的金盘与外裹的玻璃同一平面，表面光亮无划痕。将所制金电极浸入水中数小时，观察玻璃管内壁是否潮湿，考察其是否漏水，同时用万能表检测导电性。制得的电极既不漏水又具有良好的导电性，用A-B胶将玻璃管后端封闭，以固定铜丝并防止后续实验管内渗水。

1.3.2 金电极的预处理

用0.5 μm Al2O3糊进行抛光至电极表面光洁；将电极浸入Piranha溶液中浸泡3 h，以去除电极上的杂质；以0.5 mol/L H2SO4溶液为底液，在-0.8～1.0 V范围内，以100 mV/s的扫描速度进行循环伏安法(CV)扫描，电化学处理直至电流达到稳态。电化学处理完毕后，以铁氰化钾溶液(5 mmol/L Fe(CN)63-+0.1 mol/L KCl)为底液进行循环伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)扫描。

1.3.3 捕获探针S1在金电极上的自组装

滴取4 μL 14.7 μmol/L的巯基修饰捕获探针S1溶液 (HS-ssDNA)到金电极表面[11]。于4 ℃通过巯基-金化学键作用自组装成膜，每隔1 h取出，依次用Tris缓冲溶液、超纯水浸洗电极表面以除去非特异性吸附，以铁氰化钾溶液(5 mmol/L Fe(CN)63-+0.1 mol/L KCl)为底液进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，优化自组装时间，制备巯基自组装基因分子膜修饰金电极(HS-ssDNA/Au电极)。

1.3.4 信号探针S2最佳响应浓度的优化

二是优化预算执行流程。省业务主管部门按规定时限制定转移支付资金分配方案，将部门代编预算分解到基层预算单位。省财政部门全面推进国库集中支付电子化管理，改进政府采购流程，精简基建项目财政资金拨付程序。

实验过程如图1所示。将制备好的HS-ssDNA/Au电极浸入400 μL的1 mmol/L巯基己醇(MCH)中，于室温下封闭1 h[11]；用Tris缓冲溶液、超纯水浸洗后，浸入400 μL信号探针S2检测液中，于37 ℃杂交1 h，制得双链 DNA修饰金电极(HS-dsDNA/Au)；用 Tris缓冲溶液、超纯水浸洗电极；将 HS-dsDNA/Au浸入400 μL稀释度为1:500(HRP-SA:PB(pH=6.98)的体积比)的辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-SA)溶液中，于37℃培育30 min，运用生物素和链亲和素之间的特异性作用将HRP标记在基因链上。在S1、HRP-SA浓度固定的条件下，改变S2的浓度，以含有1 mmol/L对苯二酚的的磷酸缓冲溶液 PB(pH=7.38)为底液，在-0.4～0.6 V范围内进行循环伏安法(CV)扫描，寻找对苯二酚的最佳还原电位。在最佳还原电位下，在含0.5 mmol/L H2O2底液中采用电流—时间曲线法(i—t)记录电流跃迁值，优化S2最佳响应浓度。

1.3.5 目标基因S3检测

实验过程如图1所示。将制备好的HS-ssDNA/Au电极浸入400 μL的1 mmol/L巯基己醇(MCH)中，于室温下封闭1 h；用Tris缓冲溶液、超纯水浸洗后，浸入400 μL含0.51 μmol/L信号探针S2及不同浓度的目标基因S3混合检测液中，于37 ℃杂交1 h，在S2浓度保持为 0.51 μmol/L时的最佳响应值情况下，让S3与S2竞争与 S1杂交，然后进行封闭和酶标记，检测过程同步骤1.3.4。根据不同浓度目标基因的电流跃迁值，测定工作曲线。

1.3.6 自组装膜修饰金电极的再生

将杂交检测后的金电极浸在 80 ℃的热水中 3 min，使杂交产物解链，然后迅速浸入 0 ℃的冰水中浸泡30 s，使解链后信号探针和目标基因脱落，而捕获探针仍通过S—Au键固定在金表面，自组装膜修饰金电极实现再生为后续实验循环所用。此过程用交流阻抗法(EIS)表征。

2 结果与讨论

2.1 自组装时间与响应信号的关系

巯基化合物在Au表面的自组装动力学分为两步:首先是快速的吸附过程，在几分钟内完成，厚度达极限值的80%～90%；第二步为较慢的表面重组过程，一般持续数小时，厚度逐渐达到极限值，表面结构高度有序，稳定性好[12-14]。

如图 2所示，随着自组装时间的增加，HS-ssDNA/Au的差分脉冲伏安法(DPV)还原峰电流不断降低，说明不断有HS-ssDNA吸附于金表面并完成自组装基因分子层[15]。当自组装时间大于15 h，电流趋于稳定。将自组装固定15 h后的HS-ssDNA/Au于4 ℃保存一周后再检测，电流基本没有衰减，响应信号比较稳定，说明形成稳定的、完整有序的分子层。故选择最优自组装时间为15 h。

图1 自组装膜修饰金电极电化学竞争式杂交检测DNA原理示意图Fig. 1 Illustration of hybridization and competitive detection procedure by self-assembled monolayer of gold electrode

图2 不同自组装时间条件下的HS-ssDNA/Au电极的差分脉冲伏安曲线Fig. 2 DPV curves of HS-ssDNA/Au in 0.1 mol/L KCl solution containing 5.0 mmol/L ferricyanide at different self-assembled times

2.2 信号探针S2最佳响应浓度

恰当的信号探针量S2才能反应准确的检测信号。当S2量不足时，部分捕获探针S1未能与S2杂交，在后续测定目标基因时，此部分S2与无信号标记的目标基因 S3杂交，导致此部分杂交信号不被检出；当 S2量过饱和时，过饱和部分的 S2与 S3竞争杂交的信号同样未能被准确反映。两者均影响竞争杂交检测的灵敏性。因此必须优化S2的最佳响应浓度。如图3所示，当S2的浓度在0.07～0. 51 μmol/L之间时，电流—时间曲线法(i—t)[16]的电流跃迁值不断快速攀升，相对于金表面固定的S1而言，此阶段S2的量仍然不足；当S2浓度大于0.51 μmol/L时，电流跃迁值逐渐趋于稳定，此阶段 S1和 S2的量恰好完全杂交，处于动态平衡。因此，本文作者以0.51 μmol/L作为信号探针S2的最佳响应浓度。

图3 不同S2浓度下电流—时间曲线法的电流跃迁值Fig. 3 Electrical current response in current—time curve to detection probe under different concentration

2.3 金电极杂交检测的电化学表征

2.4 修饰电极的线性检测范围

电流—时间曲线法表征线性检测工作曲线[16]。在S2浓度保持为0.51 μmol/L的情况下，让S3与S2竞争与修饰电极上的 S1杂交。S3与 S2具有相同的核苷酸序列，都能与捕获探针完全杂交。由于S2的3’端连接生物素，能通过生物素和亲和素之间的特异性结合与辣根过氧化物酶标记链亲和素(HRP-SA)相连，而 S2的3’端未连接生物素则不能通过上述作用标记上辣根过氧化物酶(HRP)。通过S2与S1杂交作用留在修饰电极上的HRP保持了较高的酶催化活性，检测底液中的对苯二酚能够有效地在酶与电极之间转移电子。对苯二酚为HRP的电子媒介，在HRP催化下H2O2将对苯二酚氧化成苯醌，加入H2O2后产生明显的还原电流跃迁响应值[3]。由于HRP催化产物产生的还原电流与酶的量成正比，进而与修饰电极表面HRP标记的S2量成正比。因此在一定的浓度范围内，随着S3浓度的增加，通过碱基相互作用杂交结合在修饰电极上的 S3量增多，因此与 S1结合的 S2量相应减少，即辣根过氧化物酶标记量也相应减少，因此电流跃迁值随目标基因S3浓度增大而减小，如图4所示。

以目标基因浓度为横坐标，以电流跃迁响应值为纵坐标，绘出修饰金电极检测黄孢原毛平革菌木素过氧化物酶编码基因的低浓度段工作曲线，如图5所示。其线性检测范围为 7.51×10-12～1.05×10-9mol/L，线性回归线方程为y=-143.98x+0.252 2，其中y代表电流跃迁值(μA)，x代表 S7的浓度(μmol/L)；可决系数R2=0.996 4，误差线来源于3次重复平行实验。结果表明，S3与S2存在竞争关系，S3浓度越高，S2与修饰电极上的S1杂交结合越少，辣根过氧化物酶在修饰电极上的标记量就越少，因此电流跃迁响应值越小。检出下限是7.51×10-13mol/L。

图4 不同S3浓度下的电流—时间曲线(i—t)Fig. 4 Current—time curve of target nucleic acid under different concentrations and detection probe (0.51 μmol/L) at 37 ℃ for 1 h, using PBS (pH 7.38) containing 0.5 mmol/L H2O2 and 1 mmol/L hydroquinone

图5 目标基因检测工作曲线Fig. 5 Calibration curve of current response to target DNA under optimal experimental conditions

2.5 自组装膜修饰金电极的再生性能

根据交流阻抗图原理分析[17-18]，如图6所示，捕获探针S1能有效识别溶液中的互补序列S2和S3，杂交生成的 dsDNA增加了修饰电极表面荷负电量，同时电极表面修饰层的结构变得更为稠密，进一步阻碍了[Fe(CN)6]4-/3-与电极表面电子交换，因此电极阻抗不断增大。这种界面阻抗增加是核酸功能化电极的特性。再生处理后的自组装膜修饰金电极电阻跟封闭后的原修饰电极电阻相差无几。在同样的实验条件下，将其继续用于新一轮杂交实验后的阻抗也与上一轮杂交后的阻抗相差不大，说明经过再生处理，原有的杂交链已解开脱落而捕获探针S1仍固定于金电极表面，仍能循环利用于杂交检测，由此可得，该修饰电极具有良好的再生性能。

图6 修饰电极再生前后交流阻抗对比图Fig. 6 Electrochemical impedance spectra (Nyquist plots) of electrodes: (a) Bare gold electrode; (b) Gold electrode modified with CP (14.7 μmol/L) for 15 h and 1 mmol/L MCH; (c)Modified gold electrode with target nucleic acid (0.45 nmol/L)and DP (0.51 μmol/L) for 1 h at 37 ℃; (d) Regeneration of modified gold electrode after step (c); (e) Regenerated modified gold electrode used in hybridization under the same condition of step (c), using 0.1 mol/L KCl solution containing 5.0 mmol/L ferricyanide, with frequency range of 0.01-105 Hz,bias potential of +0.08 V and AC amplitude of 5 mV

3 结论

1) 巯基修饰的捕获探针 S1在金电极表面自组装15 h后形成稳定有序的分子膜，具有稳定的电化学性能。信号探针S2的浓度为0.51 μmol/L时，能与修饰金电极表面的S1达到饱和杂交的动态平衡，能准确反映黄孢原毛平革菌木素过氧化酶编码基因的检测信号，因此以S2浓度0.51 μmol/L为最佳响应浓度，确保竞争杂交检测的灵敏性。

2) 在目标基因 S3浓度范围为 7.51×10-12～1.05×10-9mol/L时，电化学响应信号随S3浓度增大而减小，并形成线性关系。表明 S3与 S2形成竞争关系，S3浓度越高，S2与修饰电极上的S1杂交结合越少，辣根过氧化物酶在修饰电极上的标记量就越少，因此电化学信号越小，验证了其具有竞争杂交检测机制。

4) 再生处理后的修饰金电极电阻跟封闭后的原修饰电极电阻相差无几，说明该电极再生性能良好。检出下限为7.51×10-13mol/L可实现目标基因的低浓度检测。基于该修饰金电极所建立的分析方法有望用于木质素生物降解过程中基因的快速痕量检测。

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