从核心蛋白聚糖和基质金属蛋白酶-1探讨电针对压力性尿失禁大鼠盆底组织胶原蛋白代谢的影响

张淑静,于芳,汪司右

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.河北省保定易县中医院,河北 074200)

压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是指在正常状态下无遗尿,而在腹压突然增高时尿液自动流出的表现,是一种多因素参与的复杂疾病。目前SUI的公认病因主要与妊娠、阴道分娩、年龄、运动、盆腔内肿物、妇科手术等有关。因基础研究结果存在很多争议,其确切的发病机制尚不十分清楚。以往研究表明[1-9],SUI的病机与盆底支持组织胶原蛋白异常改变有关。

本实验在笔者所在课题组以往研究[10-11]基础上,采用实时定量PCR法观察电针对SUI大鼠盆底支持组织中DCN和MMP-1 mRNA表达的影响,临床针灸治疗SUI疗效显著[11-15],本实验旨在探讨针灸治疗本病的机理,为临床针灸治疗本病提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

雌性SD大鼠(200～250 g)40只,SPF级,由上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心提供。

1.2 造模方法

1.2.1 动物造模[16-17]

参照Hijaz A的SUI大鼠模型,将大鼠麻醉,仰卧位固定后排空膀胱,将8Fr弗莱氏导尿管插入阴道,并向气囊注入2～2.5 mL生理盐水过度撑开阴道维持该状态4 h后撤出导尿管,然后按无菌操作原则进行双侧卵巢切除术,常规饲养1个月。

1.2.2 检验模型是否成功方法

①所有大鼠均测量最大膀胱容量和漏尿点压力。方法是利用硬脊膜外导管从尿道插入大鼠膀胱2～3 cm并固定,排空膀胱,通过三通管连接,一端通过微泵向膀胱注入生理盐水,一端连接尿动力学检测仪器,以尿道口出现的一滴液体为准,记录当时的最大膀胱容量和漏尿点压力值。②喷嚏实验[18]。先排空大鼠膀胱,根据测得的最大膀胱容量,注入量为容量一半的混有美兰的生理盐水,刺激大鼠鼻孔或吸入胡椒粉,致其出现喷嚏实验,仔细观察喷嚏时有无蓝色液体从尿道口流出。

1.3 动物分组与处理

将40只雌性SD大鼠随机分成4组,每组10只。正常对照组(A组)未做任何处理;SUI模型组(B组)施阴道扩张和双侧卵巢切除;对照穴电针组(C组)施阴道扩张和双侧卵巢切除,用0.30 mm×25 mm一次性针灸针针刺双侧肾俞、膀胱俞并接G6805-2型电针仪,刺激参数、疗程同D组;治疗穴电针组(D组)施阴道扩张和双侧卵巢切除,用0.30 mm×40 mm一次性针灸针针刺双侧次髎、会阳并接G6805-2型电针仪,频率5 Hz,连续波,强度4～6 V(以动物骶部和尾部颤动而不至全身颤动为宜),留针30 min,每日电针治疗1次,连续治疗l0 d。

1.4 组织取材和处理

治疗结束后4组大鼠处死,取大鼠尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带、耻骨尾骨肌和尿道周围结缔组织各约400 mg,生理盐水洗净血液,置﹣70℃低温保存,待测。

1.5 组织学观察指标及方法

用实时定量PCR法,观察尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带、耻骨尾骨肌和尿道周围结缔组织中DCN和MMP-1 mRNA的表达。

1.6 统计学方法

实验数据以均数±标准差表示,并采用方差分析的方法对数据进行统计学处理,以P＜O.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有需要造模的实验动物均采用测量最大膀胱容量和漏尿点压力和喷嚏实验检验模型是否成功,B组、C组和D组的造模成功率均达到90%。

2.1 胶原蛋白调节物DCN mRNA的表达

B组、C组、D组大鼠盆底组织DCN mRNA表达均较 A组显著增加(P＜0.05);B组大鼠盆底组织DCN mRNA表达较A组、C组、D组显著增加(P＜0.05);A组与C组、D组大鼠盆底组织DCN mRNA表达有明显差异(P＜0.05);C组、D组大鼠盆底组织DCN mRNA表达无明显差异(P＞0.05)。说明电针对照穴位与治疗穴位均可降低SUI大鼠盆底组织DCN mRNA的表达,但两组比较无统计学意义。详见表1。

2.2 胶原蛋白降解酶MMP-1 mRNA的表达

B组、C组大鼠盆底组织MMP-1 mRNA表达较A组和 D组显著增加(P＜0.05);A组、D组大鼠盆底组织MMP-1 mRNA表达无明显差异(P＞0.05);B组、C组大鼠盆底组织MMP-1 mRNA表达无明显差异(P＞0.05)。说明电针对照穴位对 SUI大鼠盆底组织 MMP-1 mRNA的表达无明显影响;而电针治疗穴位可明显降低 SUI大鼠盆底组织MMP-1 mRNA的表达。详见表2。

表1 4组大鼠盆底组织DCN mRNA表达的变化 (x±s)

表2 4组大鼠盆底组织MMP-1mRNA表达的变化 (x±s)

3 讨论

压力性尿失禁是中老年妇女常见病,属于盆底功能障碍性疾病,国际尿控协会将SUI定义为腹压突然增加时(如咳嗽、大笑、打喷嚏)导致尿液不自主流出,同时不伴逼尿肌的收缩。它虽然不是威胁生命的疾病,但难以启齿的症状严重影响妇女的生活质量和身心健康,随着人类寿命的延长和生活质量的提高,SU1日益受到国内外医学界的关注[19-20]。SUI的发病机制尚不明确,随着完整理论和吊床学说的提出,研究焦点逐渐从解剖改变转移到超微结构及功能改变[21]。盆底肌肉、筋膜及子宫韧带维持盆腔器官于正常位置,并通过维持膀胱颈和尿道的位置及尿道的闭合,来维持排尿自禁功能,控制女性尿道关闭的所有结构中,最重要的是尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带、耻骨尾骨肌和尿道周围结缔组织。胶原纤维是盆底筋膜、韧带的主要成分,是连接肛提肌至尿道的主要组织,通过胶原、肌肉对尿道发挥收缩作用。现已从各方面证实盆底结缔组织胶原异常改变为SUI的重要发病机制[1-9]。核心蛋白聚糖与胶原都是细胞外质的组成部分,DCN通过其核心蛋白与胶原的相互作用从而调节胶原纤维的生成速度,影响胶原纤维的形成和结构,修饰胶原纤维表面的d带和e带,DCN可减少局部组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量,并使胶原纤维变细[22-23]。基质金属蛋白酶是重要的胶原降解酶,也是唯一可降解纤维素类胶原的降解酶,2006年张群芳等[24]又发现SUI患者阴道壁疏松结缔组织基质金属蛋白酶MMP-2的mRNA增加及其组织抑制物TIMP-2 mRNA减少,认为二者的比例失衡,在SUI的发病过程中可能起重要作用。

本实验结果显示模型组、对照穴电针组、治疗穴电针组大鼠盆底组织DCN mRNA表达均较正常组显著增加(P＜0.05);模型组大鼠盆底组织DCN mRNA表达较正常组、对照穴电针组、治疗穴电针组显著增加(P＜0.05);对照穴电针组、治疗穴电针组大鼠盆底组织DCN mRNA表达无明显差异(P＞0.05)。模型组、对照穴电针组大鼠盆底组织MMP-1 mRNA表达较正常组、治疗穴电针组显著增加(P＜0.05),治疗穴电针组大鼠盆底组织 MMP-1 mRNA表达与正常组无明显差异(P＞0.05)。模型组、对照穴电针组两组大鼠盆底组织MMP-1 mRNA表达无明显差异(P＞0.05)。

针灸治疗 SUI[11-14]临床上常用的穴位有肾俞、次髎、会阳、中极、关元、足三里、三阴交等,我们选用临床治疗SUI的常用穴位次髎、会阳两穴,本实验结果显示电针次髎、会阳可明显降低SUI大鼠盆底支持组织 DCN和 MMP-1 mRNA表达,其中对降低 MMP-1 mRNA表达更为明显,由此可推测电针次髎、会阳主要减少胶原蛋白的降解,进一步影响 SUI大鼠盆底支持组织胶原纤维的形成,增强盆底组织支持作用,改善其控尿能力,从而达到对压力性尿失禁症状的改善。

[1] Edwall L, Carlstrom K, Jonasson AF. Markers of collagen synthesis and degradation in urogenital tissue from women with and without stress urinary incontinence[J]. Neurourol Urodyn, 2005,24(4):319-324.

[2] Rodriguez LV, Chen S. New objective measures to quantify- stress urinary incontinence in a novel durable animal model of intrinsic sphineter defieieney[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005,288(5):1332-1338.

[3] MeKinnie, Swift SE, Wang W, et a1. The effect of pregnancyandmode of delivery on the prevalence of urinary and female incontinence[J]. Am J Obstet Gynecol, 2005,193(2):512-517.

[4] Birk DE, Mayne R. Localization of collage type Ⅰ, Ⅲ and V during tendon development changes in collage types Ⅰ and Ⅲ arecorrelated with changes in fibril diameter[J]. Eur J Cell Biol, 1997,72:352-361.

[5] Lang J, Zhu L, Sun Z, et a1. Clinial study on collagen and stressurinary incontinence[J]. Clin Exp Obstet Gynecol, 2002,29(3):180-182.

[6] Ulmasten U, Falconer C. Conective tissue in female urinary incontinence[J]. Culrr Opin Obstet Gynecol, 1999,11(5):509-515.

[7] Goepel C, Hefler L, Methfessel HD, et a1. Periurethral connectivetissue status of postmenopausal women with genital prolapse with and without stress incontinence[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2003,82(7):659-664.

[8] Bakas Liapis A, Salamalekis E, et a1. Tension-free vaginal tape efficacy in relation to collagen quantity of pubocervical fascia[J].Gynecol Obstet Invest, 2004,57(3):149-152.

[9] Bakas PG, Liapis A, Zervolea I, et a1. mRNA assessment for procollagen production inwomen with genuine stress urinary incontinence[J].In Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct, 2004,15:429-431.

[10] 张淑静,汪司右,王燕.电针对压力性尿失禁大鼠盆底组织胶原蛋白表达的影响[J].上海针灸杂志,2010,29(6):408-410.

[11] Wang SY, Chen GM, Li LH. “Four sacral needles” therapy for female stress inxontinence[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2006,4(3):170-173.

[12] 叶静芳,王宇新.补脾益肾方法治疗中老年妇女尿失禁——附 56例疗效观察[J].中医文献杂志,2000,(4):46.

[13] 宓轶群,陈一.针灸治疗女性压力性尿失禁 36例[J].中国针灸,2003,23(11):640.

[14] 杨鹏飞.温针灸加 TDP照射治疗压力性尿失禁疗效观察[J].中国针灸,2004,24(7):459-460.

[15] 杨廷辉,周清毅,赵开祝.电针治疗女性压力性尿失禁临床研究[J].四川中医,2004,22(6):90-91.

[16] Hijaz A, Daneshgari F, Sievert KD, et a1. Animal models of female stress urinary incontinence[J]. J Urol, 2008,179(6):2103-2110.

[17] 邓婕,方祖军,丁强.压力性尿失禁动物模型的建立[C].第十四届全国泌尿外科学术会议(厦门)论文集,2007:74.

[18] Kaiho Y, Kamo I, Chancellor MB, et a1. Role of noradrenergic pathways in sneeze-induced urethral continence reflex in rats[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007,292(2):639-646.

[19] 段继宏,杨勇,吴士良,等.北京地区尿失禁发病率调查[J].北京医科大学学报,2000,32(1):74-75.

[20] 古力米热,夏吴,杨勇,等.新疆地区维吾尔族人群尿失禁发生率调查[J].中华泌尿外科杂志,2002,23(7):422-423.

[21] 张睿,罗来敏.产后压力性尿失禁的病理生理机制[J].国外医学:妇产科分册,2005,32(1):25-28.

[22] Douglas T, Heinemann S, Bierbaum S, et al. Fribrillogenesis of collagen types Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ with small leucine-rich proteoglycans decorin and biglycan[J]. Biomacromolecules, 2006,7(8):2388-2393.

[23] 董黎,张曦,马豫焕,等.晚孕期肛提肌Ⅰ,Ⅲ型胶原和基质金属蛋白酶﹣1表达研究[J].第三医科大学学报,2008,30(12):1148-1150.

[24] 张群芳,宋岩峰,朱忠勇.压力性尿失禁患者阴道壁结缔组织MMP-2及其抑制物的表达[J].现代妇产科进展,2006,15(2):114-116,120.