白刺果实活性成分提取及其抗氧化活性研究△

齐敬浩，张桂霞，陈贵林*

(1.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021;2.内蒙古自治区中蒙药材规范化生产工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010021)

中药科技

白刺果实活性成分提取及其抗氧化活性研究△

齐敬浩1,2，张桂霞1,2，陈贵林1,2*

(1.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021;2.内蒙古自治区中蒙药材规范化生产工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010021)

目的：白刺果实活性成分提取及其抗氧化活性的研究。方法：用70%丙酮提取白刺果实，其提取物依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取得各部分及水相，通过分光光度法测定各部分的黄酮及多酚含量，DPPH法和ABTS法测定各部分的体外抗氧化活性，大孔吸附树脂结合制备液相法对活性强的水相部分分离纯化。结果：水相部分黄酮和多酚含量较高且抗氧化活性最强，分离得到两个单体化合物，鉴定为异鼠李素-3-O-芦丁苷和异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷，并对两个单体的抗氧化活性进行测定，两个单体都有明显抗氧化活性，且异鼠李素-3-O-芦丁苷相比于异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷清除自由基的能力较强。结论：白刺果实中的黄酮及多酚具有抗氧化活性。

西伯利亚白刺果实；抗氧化；异鼠李素-3-O-芦丁苷；异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷

人体内自由基含量随年龄增长而积累，体内清除自由基的各种系统的防御能力逐渐衰退，过多的自由基会导致心、脑、肾等器官功能衰退病变[1]。多酚类和黄酮类是良好的自由基清除剂，水果特别是小浆果富含黄酮等天然酚类活性物质成分，具有多种生物活性[2]。Marja P.K等[3]测定了26种浆果的多酚及其抗氧化活性，发现不同种浆果所含多酚物质不同，均具有良好的抗氧化活性。黄酮类是植物体中普遍存在的多酚类代谢产物，具有很多生物活性，如抗过敏、抗炎、抗氧化、清除自由基和抗突变等作用，且已用来治疗糖尿病、癌症和冠状动脉性心脏病等[4]。因此，浆果是开发安全有效的天然抗氧化剂的重要原料。

白刺浆果被美誉为“沙漠樱桃”，富含生物碱、黄酮类、脂肪酸、氨基酸等生物活性成分[5]，作为重要的蒙药用于治疗肠胃疾病。课题组前期工作中，分别对唐古特白刺果实粗提物抗氧化活性及西伯利亚白刺果实粗提物抑菌活性进行了研究，研究表明其提取物均具有良好的活性[6-7]。本研究利用丙酮匀浆提取法对西伯利亚白刺果实进行提取，通过紫外分光光度法测定各萃取部分的黄酮及多酚含量，并利用体外清除自由基方法(DPPH和ABTS法)测定其体外抗氧化活性。运用大孔吸附树脂结合制备液相法对活性强的部分进行进一步的分离鉴定，并测定其活性，从而鉴定出主要有效成分，为从白刺果实中开发天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料

1.1 材料与试剂

西伯利亚白刺于2010年7月16日采集于内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗独贵塔拉镇(40°31′N，108°32′E)。经内蒙古大学陈贵林教授鉴定为西伯利亚白刺NitrariasibiricaPall.。阴干，备用。

DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)、ABTS(2，2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)、Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethychroman-2-carboxylic acid)、福林-酚试剂(Folin-Ciocalteu试剂)和没食子酸(美国Sigma公司)；乙腈色谱纯(美国Spectrum公司)；维生素C、乙醇等试剂均为分析纯；色谱柱填料Toyopearl HW-40(东曹株式会社Tosoh，日本)。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；Heidolph旋转蒸发仪(德国海道夫公司)；超导核磁共振(SC-NMR)Varian INOVA AS 600(Varian，美国)；电喷雾质谱仪为Bruker amaZon ETD电喷雾离子阱质谱仪(Bruker，德国)。

2 方法

2.1 白刺果实活性成分的提取与分离

取干燥果实100 g，70%丙酮匀浆提取(料液比：1∶3；提取次数：3次；提取时间：各0.5 h)，提取物合并后40 ℃真空旋转蒸发浓缩至300 mL。抽滤得沉淀，滤液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，每次300 mL。合并，真空旋转蒸发，干燥，得各萃取部分及水相。西伯利亚白刺果实70%丙酮提取物顺相液相图谱见图1。将水相过AB-8大孔吸附树脂，用不同浓度甲醇依次洗脱，得40%和60%甲醇部分，真空蒸发，干燥。将两部分分别经Toyoperal柱分离，用70%乙醇洗脱得到化合物1和2。

图1 西伯利亚白刺果实70%丙酮提取物顺相液相图谱

2.2 多酚含量测定

白刺果实丙酮粗提物和各萃取部分的总多酚含量的测定采用福林酚法(Folin-Ciocalteau colorimetric method)[8]。以没食子酸作为反应底物制作标准曲线，标准曲线方程为Y=0.036X-0.000 6(r=0.999 7)，Y为吸光度值，X为没食子酸浓度。

2.3 黄酮含量的测定

取白刺果实各萃取部分10 mg，溶于25 mL容量瓶中，配成浓度为0.4 mg·mL-1的溶液，精密量取对照溶液1，2，3，4，5，6 mL分别置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度线，摇匀，放置15 min，以不加氢氧化钠为对照，在500 nm紫外光下测定吸光度值，以芦丁为对照品，绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=12.95X-0.027(r=0.999)，X为芦丁浓度，Y为吸光度值。

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 白刺果实萃取物清除自由基DPPH的测定 通过测定清除DPPH自由基的能力来测定抗氧化性[9]。配制浓度为1×10-6mol·L-1的DPPH甲醇溶液，取1 mL该溶液与3 mL不同浓度的样品溶液(160，120，80，40，20，0 mg·mL-1)轻轻混匀，室温反应30 min，于517 nm处测定反应物的吸光度。以维生素C为对照。样品清除能力用所加样品较空白对照的DPPH吸光度的降低来表示。样品抑制百分率按公式计算。

抑制率(%)=(1-AA/AB)×100。

式中：AA为加样品后DPPH吸光度，AB为空白对照的吸光度。IC50表示能够清除50%自由基所需的样品浓度。IC50从样品清除率的线性曲线计算可得。

2.4.2 清除ABTS自由基能力的测定 清除ABTS自由基能力测定参考Re等[10]的方法，计算每分子抗氧化物质捕捉ABTS自由基的数目(TEAC值)。Trolox标准曲线方程为Y=4.096 0X+8.961 0，(r=0.992 1)，Y为消除率(inhibition)，X为浓度。

2.5 数据分析

3 结果

3.1 白刺果实丙酮提取物及各萃取部分多酚及黄酮含量

采用70%丙酮水溶液提取干燥的西伯利亚白刺果实，丙酮粗提物及各萃取部分的多酚含量用每克干重的提取物中含有多少毫克的没食子酸来表示。从表1可以看出，乙醚萃取物多酚含量最高，其次为乙酸乙酯、正丁醇和水相部分，而黄酮类化合物含量高低依次为乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相部分，沉淀含量最低。其中乙醚萃取物多酚和黄酮类化合物含量最高，但是乙醚萃取部分得率(0.67%)比较低，不适合进一步进行分离提取。

表1 白刺果实丙酮粗提物及各萃取部分的多酚含量和TEAC

3.2 各萃取部分抗氧化活性测定

从表1可以看出，在4种萃取物中，乙醚萃取物的活性最强，为(5.68±0.14)mmol·L-1，是维生素C的0.4倍，其次是水相(4.13±0.24)mmol·L-1，乙酸乙酯的清除能力紧随其后，沉淀的活性最弱。

由图2可见，DPPH法与ABTS法测定结果类似。乙醚萃取物比其他部分的抗氧化活性强，随着浓度增大而上升，当浓度为90 μg·mL-1时，自由基清除率达到最大的77.37%，此后随浓度的增加自由基清除率变化不大。水相部分浓度大于30 μg·mL-1时，自由基清除率随着浓度增加迅速上升，当浓度达到120 μg·mL-1时，自由基清除率接近于乙醚部分，达到最大的78.31%。乙酸乙酯萃取物清除自由基率与浓度呈良好的线性关系(r=0.979 7)。正丁醇萃取物对自由基清除率接近于乙酸乙酯萃取物，沉淀的清除自由基能力最弱，且随浓度变化不大。因此，水相部分有较多的多酚和黄酮类化合物，抗氧化能力较强，且该部分得率较高(17.1%)，适合进一步对其进行分离提取主要有效成分。

图2 不同浓度白刺果实提取物DPPH自由基清除率

3.3 两个化合物的分离鉴定

对主要活性部位利用大孔吸附树脂结合制备液相法对活性强的部分进一步分离纯化，得到两个主要的单体化合物，鉴定分析并对两个化合物的抗氧化活性进行评价。

化合物1：黄色粉末，1H-NMR(400 MHz，acetone-d6+D2O)图谱中槲皮素的H信号(δ 6.21，6.41，7.05，7.68，7.72)，甲氧基上H信号为(δ 3.93)。13C-NMR(151 MHz，acetone-d6+D2O)图谱中共发现有28个碳信号，15个构成槲皮素骨架结构，12个构成两个六碳糖，1个形成为甲氧基碳。依据化学位移及耦合常数推断，其中一个为β葡萄糖(H-1的耦合常数为7.8 Hz)，另一个为鼠李糖。葡萄糖6号碳化学位移向低场移动，推测鼠李糖与葡萄糖1～6位相连，此苷元应该为芦丁苷。HMBC图谱中，鼠李糖H-6″′(δ 1.10)与葡萄糖C-1″(δ 105.3)相连，葡萄糖端基氢(δ 5.1)与槲皮素骨架C-3(δ 136.6)相连，推断芦丁糖上3号C与骨架相连。另外，甲氧基氢(δ 3.93)与C-3′(δ 152.5)相连。结合以上数据分析并与文献值[11]比较，推断化合物1为异鼠李素-3-O-芦丁苷Isorhamnetin-3-O-rutinoside(narcissin)(见图3)。

化合物2：黄色粉末，该化合物为含1个葡萄糖、1个芦丁的异鼠李素苷。HMBC图谱中，鼠李糖H-6″′(δ 1.10)与葡萄糖C-1″(δ 103.20)相连，葡萄糖端基氢(δ 5.13)与槲皮素骨架C-3(δ 136.76)相连，推断芦丁糖在C-3与骨架相连[12]。另一个葡萄糖的端基氢(δ 5.21)与C-7(δ 165.59)相连，由此可知该葡萄糖连接在C-7位置。与文献[13]比较，推测该化合物为异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside(见图3)。

两个单体化合物的抗氧化活性用TEAC值表示，由表1可见，抗氧化能力要比其他所有部分都要强，与对照维生素C的抗氧化能力相当，但是异鼠李素-3-O-芦丁苷要比异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷抗氧化能力强。

化合物1：R1=rutin，R2=H；Isorhamnetin-3-O-rutinoside化合物2：R1=rutin，R2=glc；Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside图3 异鼠李素-3-O-芦丁苷(化合物1)和异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷(化合物2)化学结构

4 讨论

许多研究表明，酚类物质是蔬菜、水果中的主要抗氧化成分[14]。因此本研究中我们利用ABTS和DPPH两种方法对西伯利亚白刺果实各萃取部分抗氧化能力进行了测定，并对每一萃取部分所含的多酚含量与黄酮含量进行了测定。发现在各萃取物中，乙醚萃取物多酚含量和黄酮类物质最高，抗氧化活性最强，水相次之，沉淀最弱。其中水相部分多酚含量没有乙酸乙酯和正丁醇萃取物含量高，但其清除自由基活性明显高于这两部分，这可能是因为水相部分中包含其他高极性非多酚类的化合物。

Katalinic等[15]通过对70种药用植物总酚和总抗氧化能力FRAP的比较，发现抗氧化活性与总酚含量有极显著的相关性，且相关系数为0.982 5。而本研究结果显示多酚含量与抗氧化能力存在相关关系，但是相关性不高，这可能是由于植物中的各种天然抗氧化成分之间往往具有协同增效作用，如维生素C可能会对多酚物质的抗氧化活性产生间接影响，这与之前报道的总多酚含量与其抗氧化活性并非直接相关是一致的[16]。黄酮类化合物清除自由基的最主要机制是通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应，本研究却未发现黄酮类含量与抗氧化能力存在相关性，可能是与作者所采用抗氧化指标体系不同有关。

本研究利用大孔吸附树脂结合制备液相法对抗氧化活性强的水相部分进行进一步的分离鉴定，初步分离出两个单体，异鼠李素-3-O-芦丁苷和异鼠李素-3-O-芦丁-7-O-葡萄糖苷。史天星等[17]曾对远志地上部分10种黄酮类成分进行分离及抗氧化活性测定，发现其中6种黄酮类成分具有明显抗氧化活性，异鼠李素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷和异鼠李素活性最强。课题组对这两个化合物进行了抗氧化能力的测定，发现也具有很强的清除自由基能力，相比于其他槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等活性要强。Boubaker等[18]对异鼠李素-3-O-芦丁苷的抗癌细胞进行了测定，发现异鼠李素-3-O-芦丁苷可以诱导慢性粒细胞白血病(K562)细胞凋亡。因此，这两种单体化合物相比于各萃取粗提部分都有更强清除自由基的能力，这两种化合物提取率较高，抗癌和抗氧化的作用明显，具有开发利用价值。

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ResearchonActiveComponentExtractionofNitrariasibiricaPall.FruitandTheirAntioxidantActivity

QI Jing-hao，ZHANG Gui-xia，CHEN Gui-lin*

(CollegeofLifeScience，InnerMongoliaUniversity，Hohhot010021，China)

Objective：Research on active component extraction ofNitrariasibiricaPall.fruit and their antioxidant activity.Methods：Fruits ofNitrariasibiricaPall.were extraced by 70% acetone，then ether，ethyl acetate and n-butanol successively.The contents of flavonoid and total polyphenol in each fraction were determined by UV spectrophotometry，the antioxidant activity of each fraction were determined based on the method of DPPH and ABTS which can evaluate the ability of in vitro antioxidant.The crude extract of water fraction was separated and purificated by combined use of macroporous resin and preparative HPLC.Results：Water fraction had the highest antioxidant activity and relatively high content of flavonoid and total polyphenol，we isolated two monomer compounds，the compounds were determined to be isorhamnetin-3-O-rutinoside and isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside by HNMR and the antioxidant activity of these two monomer compounds were determined.The result showed that both of the two monomer compounds have obvious antioxidant activity，and in vitro anti-oxidant ability of isorhamnetin-3-O-rutinoside is higher than isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside.Conclusion：The flavonoid and polyphenol ofNitrariasibiricaPall.fruit have high antioxidant activity.

NitrariasibiricaPall.fruit；Antioxidant activity；Isorhamnetin-3-O-rutinoside；Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside

2013-03-29)

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国家科技支撑计划项目(2011BAI07B07)，内蒙古科技创新引导奖励资金项目(2010)

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陈贵林，教授，博士生导师，研究方向：药用植物化学，E-mail：guilinchen61@163.com