HPLC测定吐根中吐根碱和吐根酚碱的含量

王超，裴彩云，王宗权，宋剑，贾继明

(石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035)

HPLC测定吐根中吐根碱和吐根酚碱的含量

王超，裴彩云，王宗权，宋剑*，贾继明

(石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035)

目的：建立吐根中吐根碱和吐根酚碱含量测定的方法，为该药材质量控制提供依据。方法：色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05%三乙胺(40∶60)；检测波长：283 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；进样量：10 μL。结果：吐根碱和吐根酚碱在HPLC中分离良好，且两种生物碱在1.0～10.0 μg·mL-1线性关系良好，平均回收率分别为95.8%，96.6%，RSD分别为1.2%，1.5%。3批吐根药材中吐根碱含量为0.93～0.98 mg·g-1；吐根酚碱的含量为1.43～1.48 mg·g-1。结论：利用高效液相色谱对吐根中吐根碱和吐根酚碱进行含量测定，方法简便，准确度高，重现性好，可应用于吐根碱和吐根酚碱的含量测定。

含量测定；吐根碱；吐根酚碱；吐根；高效液相色谱

吐根为茜草科植物Cephaelisipecacuanha(Brot.)A.Rich.或C.acuminataKarsten的干燥根及根茎。主产巴西，我国广东、云南、台湾有引种栽培，用作抗阿米巴药、镇咳剂(祛痰)、催吐剂，常在止咳药处方中出现。吐根主要活性成分为生物碱，其中吐根酚碱、吐根碱占药材生物碱总量的90%，均为异喹啉型生物碱。《欧洲药典》(EP)、《美国药典》(USP)和《日本药局方》(JP)[1-3]均有收载。吐根具有一定的毒性，其毒性成分和治疗成分都是以盐酸吐根碱和盐酸吐根酚碱为主的总生物碱，常用的测定方法为滴定法、显色法等，缺少对成分的精确控制[4-5]。为了能更有效控制其质量，作者采用高效液相色谱法对吐根药材的药用部位进行吐根酚碱、吐根碱的含量测定。

1 仪器与试剂

美国Waters 2695型高效液相色谱仪；KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率33 kHz),BS2202S电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

乙腈、三乙胺(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯，其余试剂均为分析纯。盐酸吐根酚碱对照品(International Laboratory USA公司，批号：325166)，盐酸吐根碱对照品(美国Sigma 公司，批号：061M1826V)，吐根药材为市售产品(产地：巴西)，经河北省药品检验所孙宝惠主任中药师鉴定为Cephaelisipecacuanha(Brot.)A.Rich.的根及根茎。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称取盐酸吐根酚碱、盐酸吐根碱对照品适量，用乙腈溶解，分别制成0.20 mg·mL-1溶液作为盐酸吐根酚碱、盐酸吐根碱对照品储备液。

2.2 供试品溶液的制备

称取吐根药材5 g于300 mL具塞锥形瓶中，加入70%乙醇100 mL，1 mL盐酸，密塞，称定重量。超声提取1 h，放冷，用70%乙醇补足失去的重量，摇匀、离心过滤，滤液用水定容至100 mL，记为A，取50 mL备用。将滤液A旋转蒸发至无醇味，加水至30 mL，用10%氢氧化钠溶液调pH到10，用乙醚萃取3次，用量1∶1，收集乙醚层，水浴挥干溶剂，残渣用乙腈溶解并定容至25 mL，取1 mL，用乙腈稀释并定容至10 mL，记为B。将A、B过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液测定。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.05%三乙胺(40∶60)，使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤并脱气；检测波长：283 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温为室温；进样量：10 μL。理论塔板数以吐根酚碱计不少于6 000。

在此条件下，对照品、供试品溶液的色谱图如图1所示，光谱图如图2所示。

A.吐根酚碱对照品 B.吐根碱对照品 C.吐根药材a.吐根酚碱 b.吐根碱图1 吐根药材及对照品HPLC图

A.吐根酚碱对照品 B.吐根碱对照品 C.吐根药材图2 吐根药材及对照品光谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取吐根酚碱对照品溶液4，8，12，16，20 μL注样分析，以X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标作图，进行线性回归，同法操作吐根碱对照品溶液，进行线性回归，得回归方程。吐根酚碱回归方程为Y=1.536×10-4X+0.247，r=0.999 3;吐根碱回归方程为Y=1.304×10-4X+0.651，r=0.999 6，说明吐根酚碱和吐根碱质量浓度在1.0～10.0 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验 按2.2方法制备1份样品，重复进样5次，每次10 μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果吐根酚碱、吐根碱峰面积积分值的RSD分别为1.18%和1.03%，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 按2.2方法制备1份样品，分别于0，2，4，6，8 h精密吸取20 μL，按2.3色谱条件测定，记录峰面积积分值，结果吐根酚碱、吐根碱峰面积积分值的RSD分别为2.39%和2.43%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同批样品5份，按2.2方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定，结果吐根酚碱、吐根碱质量分数的RSD分别为1.45%，2.38%，表明重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 称取已知含量的同批样品，称重6份，分别精密加入一定量的吐根酚碱和吐根碱对照品，按2.2方法制备样品并按上述色谱条件测定，结果见表1、表2。

表1 吐根中吐根酚碱的加样回收率试验

表2 吐根中吐根碱加样回收率试验

2.5 样品含量测定

按供试品制备方法制备得3批提取物(批号：120501，120502，120503)的供试品溶液。对照品溶液及供试品溶液按上述色谱条件测定，按吐根酚碱、吐根碱的峰面积，外标法计算吐根酚碱、吐根碱的含量，结果见表3。

表3 吐根中吐根碱和吐根酚碱含量测定结果 /mg·g-1

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

比较了酸水提取、酸醇提取吐根生物碱，结果表明70%乙醇和适量盐酸的提取效果更好。

3.2 纯化方法考察

考察了大孔吸附树脂纯化生物碱、离子交换树脂纯化生物碱、有机溶剂萃取生物碱、酸碱沉淀法纯化生物碱。结果大孔吸附树脂法、离子交换树脂法及酸碱沉淀法纯化生物碱转移率低，且纯度低，不利于吐根酚碱、吐根碱的进一步分离纯化。有机溶剂萃取法转移率高、且生物碱纯度高。

3.3 不同pH对纯化的影响

通过调节不同pH值8、9、10、11考察了pH对生物碱分离的影响，结果表明pH为10以上时，分离纯化效果好，转移率高。

3.4 检测波长选择

对吐根生物碱对照品溶液及供试品溶液在波长200～400 nm进行扫描，均在(283±1)nm内有最大吸收，因此选283 nm为检测波长。

4 小结

从方法学验证可以看出建立的HPLC方法有良好的线性、重复性、稳定性、加样回收率，证明该方法准确可靠，可用于吐根药材中生物碱含量测定。

[1] Strasbourg,France:European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia[S].2010: 1155-1156.

[2] Rockville,USA:The United States Pharmacopeial Conventio. USA Pharmacopoeia(USP32-NF27)[S].2009: 2682.

[3] Tokyo，Japan：Society of Japanese Pharmacopoeia.The Japanese Pharmacopoeia[S].2006: 1303.

[4] 许立颖，宋伟峰.吐根醚溶性生物碱提取工艺研究[J].中国医药导报，2011,8(11)：60-61.

[5] 伊藤笃子.吐根的生物碱成分[J].国外医学·中医中药分册，1992,21(6)：26

DeterminationofEmetineandCephaelineinCephaelisipecacuanhabyHPLC

WANG Chao，PEI Cai-yun，WANG Zong-quan，SONG Jian*，JIA Ji-ming

(ShijiazhuangYilingPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shijiazhuang050035，China)

Objective：To establish a method for the determination of emetine and cephaeline inCephaelisipecacuanhaby HPLC.Methods：A ZORBAX Eclipse C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)was used with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.05% triethylamine (40∶60).The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detective wavelength was 283 nm.Column temperature was room temperature and the injection volume was 10 μL.Results：Two alkaloids were separated well，the calibration curves showed good linear response over the range from 1.0 to 10.0 μg·mL-1for the two alkaloids.The mean recoveries rate were 95.8% (RSD=1.2%，n=6)and 96.6% (RSD=1.5%，n=6)respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used forCephaelisipecacuanhaquality control.

Determination；Emetine；Cephaeline；Cephaelisipecacuanha；HPLC

2013-02-16)

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宋剑，硕士，副主任中药师，主要从事中药新药研发工作,E-mail：songjian@yiling.cn