对甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株筛选

郭 靖， 周子珊， 蔡吉林， 惠识瑶， 张 杰， 高继国， 束长龙＊

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］属于鳞翅目夜蛾科，是一种间歇性暴发为害的农业害虫。随着农业种植结构改变和受全球气候持续变暖因素的影响，其对蔬菜、棉花等经济作物造成严重的危害，并呈逐年上升趋势［1］。由于化学杀虫剂滥用而造成诸多负面影响，生物农药逐渐受到了全球的关注与重视［2］。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）自1938年产业化以来成功发展为目前全球应用最广的微生物杀虫剂，在害虫的防治中起到了越来越重要的作用［3－5］。目前国外商业化的Bt杀虫剂主要有 Agree、Biobit、Condor、Cutlass、Dipel、Full－Bac、Javelin、Xentari等，这些产品所含有的晶体蛋白，主要是以B.thuringiensis subsp.kurstaki亚种（Btk）HD－1等菌株为主所产生的Cry1类或Cry2类蛋白［6］；其中对甜菜夜蛾有较好杀虫活性的商业化杀虫剂包括Agree和Xentari等。我国在防治夜蛾科害虫的苏云金芽胞杆菌研究和应用方面也取得了一定成效，郑大胜等从3 100株野生型Bt菌株中筛选到对甜菜夜蛾高毒菌株13株［7］。牛桂兰［8］、金大勇［9］等分别筛选获得了对甜菜夜蛾等害虫高效的Bt菌株。但是，目前国内用于防治甜菜夜蛾的Bt产品生产的菌株数量有限，其中武汉科诺公司的KN11菌株已经成功产业化十余年。

作者从本实验室分离的Bt菌株中筛选对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株，获得了一株与生产菌株KN11毒力相当的菌株，并进行了杀虫基因鉴定和毒素蛋白的分析，为新型Bt杀虫基因分离克隆与制剂的开发应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

阳性对照菌株KN11为武汉科诺生物科技股份有限公司惠赠；G03菌株为实验室保存。

Bt分离株菌株为本实验室从国内采集的土壤中分离获得，完成了形态学观察和初步的生物活性测定。

1.1.2 培养基

液体LB：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1%NaCl，pH 7.0，15磅灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基：3% 牛肉膏，5% 蛋白胨，pH 7.0，15磅灭菌20min。

1.1.3 试虫人工饲料及试虫来源

甜菜夜蛾试虫饲料由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组提供；

甜菜夜蛾由武汉科诺生物科技股份有限公司提供。

1.1.4 生化试剂

引物由上海生工生物公司合成，Taq酶等PCR扩增试剂购自TaKaRa公司，其他试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

菌株筛选引物设计：通过文献检索，确定对夜蛾科害虫具有高活性的cry基因有：cry2A、cry9、cry1B、cry1C［10］、vip3A［11］、cry1Ea［12］；分 别 将 这 6种基因进行聚类分析，在保守区设计特异性引物，并对本实验室保存的192株对鳞翅目具有高活性的Bt菌株进行筛选。

采用PCR－RFLP的方法对cry1A 基因型进行鉴定；鉴定方法参照文献［13］。

几丁质酶基因鉴定引物设计：收集GenBank中Bt的几丁质酶序列，聚类分析后设计鉴定引物。cry基因特异性鉴定引物及几丁质酶基因鉴定引物见表1。

表1 PCR鉴定引物及其序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒图谱分析

提取Bt菌株的大质粒，并进行电泳分析。大质粒提取方法、电泳方法参见文献［14］。

1.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体类型观察

电镜样品制备：将Bt菌株在1／2LB平板上划线培养，30℃培养36h（约50%产生晶体）。收集菌体，灭菌水洗3次，12 000r／min离心10min收集芽胞和晶体的混合物。将沉淀悬浮在1mL灭菌水，混匀后，取少量菌液均匀涂于1cm2薄玻璃片上，晾干备用。

电镜观察：离子溅射喷金（2nm），扫描电镜观察。

1.2.4 苏云金芽胞杆菌菌株晶体蛋白SDS－PAGE分析

Bt菌株菌粉SDS－PAGE分析方法：取0.1g菌体，1mol／L NaCl洗，灭菌水反复洗3次，取处理后的样品100μL，加入25μL 0.5mol／L的NaOH，室温反应5min，加入5×Loading Buffer混匀，dd H2O补齐体系至200μL，100℃煮5min，12 000r／min离心5min，吸取上清液进行加样，进行SDSPAGE分析；以牛血清白蛋白（BSA）为标准计算菌粉的胞晶含量。

1.2.5 蛋白条带的质谱鉴定

SDS－PAGE电泳分析后，考马斯亮蓝R－250染色分析蛋白条带，并小心切取所有蛋白条带分装于Ep管中，送往北京华大蛋白质研发中心有限公司进行质谱分析。

1.2.6 苏云金芽胞杆菌生长曲线的测定

菌种活化：接种苏云金芽胞杆菌于5mL液体LB培养基中，过夜培养。

生长曲线测定：将过夜培养物转接到100mL牛肉膏蛋白胨培养基中（1%的接菌量），30℃，220r／min条件下培养，每1h测定A600值，重复3次，绘制出菌株的生长曲线。

1.2.7 苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因的检测

以Bt菌株总DNA（实验室保存）为模板，kchi5和kchi3（表1）为鉴定引物，利用PCR的方法对Bt菌株几丁质酶基因进行鉴定。

扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸，10min。

1.2.8 室内杀虫活性测定

样品制备：挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，30℃220r／min培养12h后，转接于200mL液体牛肉膏蛋白胨培养基中（1% 接菌量），30℃220r／min，培养至裂解产生晶体后（50% 以上），离心收集菌体，冷冻干燥－70℃保存备用。

甜菜夜蛾生物活性测定：生测样品准备同上，放入24孔板后晾置，每孔接初孵龄幼虫1头，每个处理3次重复，25℃，培养7d后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况，计算校正死亡率［15］。LC50值测定梯度设置（1.0mg／mL，按照3倍梯度稀释，1／3倍，1／9倍，1／27倍，1／81倍，1／243倍）。

1.2.9 数据分析

采用POLO软件计算LC50值［16］，待测样品与阳性对照的LC50的比较采用成组法t检验（Independent two samples t test），P＜0.05为差异显著，所有统计分析在SPSS 16.0软件中进行。

2 结果与分析

2.1 Bt菌株的cry基因筛选

利用所设计的特异性引物（表1）对本实验室保存的192株对鳞翅目具有较高杀虫活性的Bt菌株进行筛选，得到15株基因型丰富的Bt菌株（表2）。

表2 分离菌株cry基因筛选表1）Table 2 Screening table for isolating crygene

2.2 Bt菌株的大质粒图谱分析

提取筛选的15株Bt菌株的大质粒，电泳分析结果显示：15株Bt菌株可分为8种类型。如图1所示：其中 PS8－B2、PS4－C9、PS3－C5和 PS3－C2同属于一种类型；PS1－G3、PS1－F3、PS1－G6、PS1－G7和 SCLB3同属于一种类型，其余6种菌株各不相同。

图1 Bt菌株质粒图谱分析Fig.1 Plasmid profile of Bt strain

2.3 Bt菌株晶体类型观察

对8种类型的代表菌株进行晶体类型观察，这8株菌株中含有的晶体类型包括双锥体形、球形、方形等（图2）。

2.4 杀虫晶体蛋白的SDS－PAGE分析

通过SDS－PAGE分析了8株Bt菌株所表达的Cry蛋白（图3）。其中菌株PS1－F11和SCL－B3既表达130ku的蛋白又表达60ku左右的蛋白，PS8－B11同时表达130ku和70ku左右的蛋白，其余菌株均表达130ku左右的蛋白。

电泳图片用ImageJ（v1.43）软件进行定量分析，各菌株发酵后的胞晶混合物中晶体蛋白含量定量分析结果见表3。

2.5 生物活性测定

菌株对甜菜夜蛾的初筛结果显示：菌株PS3－C2和PS1－F11与阳性对照G03和KN11校正死亡率（1.0mg／mL和5.0mg／mL时）接近，因此选择这两株菌株进行甜菜夜蛾致死中浓度的测定。

表3 菌株胞晶混合物杀虫晶体蛋白含量Table 3 Contents of insecticidal proteins in bacterial cell crystal mixtures

表4 Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的生物活性初步测定Table 4 Preliminary bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

根据菌株蛋白定量计算出的胞晶含量计算出晶体蛋白的致死中浓度。生物活性测定结果表明，菌株PS3－C2与KN11活性相当，且与对照菌株KN11在P＜0.05水平上差异不显著。

在菌株干粉水平上，菌株PS3－C2对甜菜夜蛾表现出很好的杀虫活性；在计算为蛋白含量时菌株PS3－C2同样表现出了很好的杀虫活性，有的菌株虽然胞晶含量较高，但是，相比之下杀虫活性并不高；所以综合各因素，菌株PS3－C2具有比较好的应用前景。

2.6 苏云金芽胞杆菌生长曲线的测定

通过生长曲线的测定，对8株菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长特性进行比较，结果表明：在牛肉膏蛋白胨培养基中，各菌株的生长速度差别不大（图4）。

表5 Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的生物活性测定Table 5 Bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

图4 菌株生长速率比较（牛肉膏蛋白胨培养基）Fig.4 Growth rate of different Bt strains

2.7 苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因及其活性检测

利用鉴定引物（表1）对8株Bt菌株几丁质酶基因进行PCR检测，电泳结果表明：这8株菌株在2 000bp左右均有明显的扩增条带，且扩增条带大小为2 030bp（图5），说明这8株菌株中均有几丁质酶基因的存在。

2.8 蛋白质谱分析

根据生物活性数据结果显示（见表5），菌株PS3－C2对甜菜夜蛾具有很好的杀虫活性，通过SDSPAGE分析对这株菌株进行了蛋白质谱的分析，结果表明，菌株PS3－C2内含有Cry1C蛋白。

图5 菌株几丁质酶基因PCR检测结果Fig.5 PCR amplification of bacterial chitinase gene

表6 质谱分析结果Table 6 Mass spectrum analysis

3 讨论

Bt作为一种与环境友好的微生物杀虫剂，具有巨大的应用前景，在绿色植保中占有重要的地位［17－18］。本研究从192株对鳞翅目害虫有活性的菌株中，筛选出3株对甜菜夜蛾具有较强毒杀作用的菌株，发现PS3－C2菌株与目前国内生产菌株KN11毒力相当。同时进行了晶体形态特征、SDS－PAGE、生长曲线、几丁质酶和杀虫蛋白基因鉴定等研究，这些结果为新的Bt基因分离克隆和杀虫剂的开发奠定了基础。

Bt菌株的杀虫活性高低与其所含有的杀虫基因密切相关，经过基因鉴定，本研究获得的对甜菜夜蛾高毒力的菌株PS3－C2中含有对甜菜夜蛾高毒力的cry1C基因［19］，蛋白质质谱分析结果证实该菌株能表达Cry1C蛋白，从分子水平证明了该菌株高毒力的成因。

本研究通过PCR的方法鉴定了菌株中的几丁质酶基因，发现8株菌株中均含有几丁质酶基因。据林毅等报道几丁质酶具有增强杀虫晶体蛋白杀虫效果的作用［20－21］，几丁质酶在Bt杀虫作用中扮演着重要角色，重视这个毒力因子的作用，将为新一代Bt产品的研发提供更多的选择。

以往评价Bt菌株杀虫效果多以发酵液和干粉直接进行计算。而不同菌株的生物学特性差异很大，其发酵液和干粉中杀虫晶体蛋白的含量差异更大，仅以发酵液的倍数或干粉的质量来计算生测数据，菌株之间的可比性不大。本研究采用NaOH溶解方法对发酵干粉中杀虫晶体蛋白进行定量，测算出晶体蛋白的LC50，这种方法上的改进能够更加准确地评价菌株的杀虫活性，筛选出真正高毒力的菌株。

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