大蒜多糖对甲醛所致人胚肝细胞损伤的保护作用

包永芬 单士刚

甲醛(FA)是一种无色、强嗅的刺激性气体，它具有来源广泛、污染时间长、相对污染水平高、生物毒性大等特点，因此，越来越受到人们的广泛关注。FA是常见的装修型化学污染物之一，氧化损伤和DNA链断裂为甲醛毒作用的重要机制［1，2］。有报道，甲醛吸入可引起小鼠脑、肝、心等多种组织器官的蛋白质、脂质和酶的氧化损伤［3，4］。大蒜多糖(garlic polysaccharide，GP)是大蒜的主要成分之一，研究表明具有抗氧化、保护肝脏等多方面的生理功能［5］。为了探讨大蒜多糖对肝细胞的营养和保护作用，本研究以健康人胚肝细胞L02为对象，用甲醛造成细胞损伤模型，观察不同浓度的大蒜多糖对L02细胞的遗传损伤和抗氧化效果，为临床防治甲醛致病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人正常肝细胞L02购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。低熔点琼脂糖、胎牛血清和1640培养基均为Gibco公司产品。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 大蒜多糖提取分离 新鲜大蒜去皮→碾成蒜泥→无水乙醇浸泡过夜→尼龙布过滤→沉淀用无水乙醇浸泡1 h→尼龙布过滤→沉淀用无水乙醇浸泡24 h→尼龙布过滤→沉淀(即脱脂蒜泥)用双蒸水溶解→沸水浴8 h冷却→尼龙布过滤→滤液中滴加4～5倍无水乙醇→静置72 h抽滤→滤液68℃水浴约8 h蒸出乙醇→滤液中滴加3～4倍丙酮→静置6 h抽滤→得大蒜多糖组分C粗品。粗品Sevage法去蛋白后于55℃红外线干燥得淡黄色粉末即GP。

1.3 实验分组 L02细胞培养于含5%胎牛血清的RPMI1640培养基。细胞经0.25%胰蛋白酶消化传代后置含5%CO2的37℃培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。共设5组：对照组(正常细胞组)、甲醛损伤组(0.1 mmol/L)及低、中、高剂量大蒜多糖(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)保护组;其中大蒜多糖先与细胞预孵8 h后加入甲醛，置CO2培养箱培养4 h后，检测相关指标。

1.4 细胞DNA损伤的检测 用单细胞琼脂糖凝胶电泳(single cell gelelectrophoresis，SCGE)评价大蒜多糖各浓度实验组处理L02细胞4hDNA的损伤程度。每个样本用cAsP软件随机分析1 000个细胞的彗星尾距。

1.5 AST、LDH、MDA、SOD和GSH-Px的测定 分别收集大蒜多糖各浓度实验组处理L02细胞4h时的上清液和细胞裂解液。选择释放到上清的AST和LDH反映肝细胞受损程度，细胞MDA水平反映脂质过氧化程度，GSH和SOD水平反映内源抗氧化能力的大小。(1)上清指标测定：酶动力学法测定LDH、AST，具体步骤按试剂盒说明操作。(2)细胞指标测定：1%Triton-X 100裂解细胞，硫代巴比妥酸比色法测定MDA;黄嘌呤氧化酶法测定SOD;DNTB比色法测定GSH。具体步骤按试剂盒说明操作。Lowry法进行蛋白定量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜多糖对甲醛引起的细胞DNA损伤保护作用 采用单细胞凝胶电泳法检测发现，在0.1 mmol/L水平时，甲醛对L02细胞DNA的损伤。Tail Moment和Tail DNA与对照组相比有统计学意义(P＜0.01);预孵大蒜多糖1 h后的L02细胞加入0.1 mmol/L甲醛作用4 h后与甲醛损伤组比较，Tail Moment和Tail DNA都明显减少，并与大蒜多糖浓度增加呈剂量-效应关系，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同浓度大蒜多糖预孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露组细胞DNA损伤 n=6

2.2 LDH、AST、MDA 水平和 SOD、GSH-Px活性的变化0.1 mmol/L甲醛可以使L02细胞上清液中的LDH漏出量、AST和MDA的释放量释放增加，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，SOD和GSH-Px的活性下降与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);预孵大蒜多糖1 h后的L02细胞加入0.1 mmol/L甲醛作用4 h后与甲醛损伤组比较细胞内SOD和GSH-Px活性明显增加，LDH漏出量、AST和MDA的释放量明显减少，并与大蒜多糖浓度增加呈剂量-效应关系，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同浓度大蒜多糖预孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露组氧化性损伤指标n=6，±s

表2 不同浓度大蒜多糖预孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露组氧化性损伤指标n=6，±s

注：与甲醛组比较，*P＜0.05;与对照组比较，#P＜0.05

组别 LDH(U/L)AST(U/L)MDA(nmol/ml)GSH(mg/mg)SOD(U/ml)±0.08甲醛组 12.6±0.4# 2.73±0.45# 1.98±0.23# 58.41±5.17# 3.25±0.48#预处理组(mg/L)对照组 7.0±0.9 1.52±0.23 0.93±0.12 99.10±8.56 4.99 20 10.7±1.0* 1.80±0.21* 1.37±0.16* 70.27±6.72* 3.47±0.54 40 9.2±0.9* 1.74±0.25* 1.05±0.31* 75.96±8.86* 5.05±0.52*80 7.6±0.8* 1.52±0.10* 1.03±0.62* 85.83±5.70* 4.84±0.16*

3 讨论

本文研究了大蒜水提取物(GP)对甲醛诱导氧化损伤和遗传损伤的抑制作用。实验分为5组：对照组，甲醛组，大蒜多糖预处理组：分设20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L不同浓度预处理组。采用单细胞凝胶电泳法检测发现，在0.1 mmol/L水平时，甲醛对L02细胞DNA的损伤。结果表明Tail Moment和Tail DNA与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);预孵大蒜多糖8 h后的L02细胞加入0.1 mmoL/L甲醛作用4 h后与甲醛损伤组比较，Tail Moment和Tail DNA都明显减少，并与大蒜多糖浓度增加呈剂量-效应关系，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。0.1 mmol/L甲醛可以使L02细胞上清液中的LDH漏出量、AST和MDA的释放量释放增加，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，SOD和GSH-Px的活性下降与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);预孵大蒜多糖8 h后的L02细胞加入0.1 mmoL/L甲醛作用4 h后与甲醛损伤组比较细胞内SOD和GSH-Px活性明显增加，LDH漏出量，AST和MDA的释放量明显减少，并与大蒜多糖浓度增加呈剂量-效应关系，其差异均有显著性(P＜0.05)。上述实验结果表明，GP有较强的抗氧化作用和遗传损伤的保护作用，它可能通过保护组织不受氧化损伤和遗传损伤而拮抗甲醛的毒性。然而GP的这些作用可能具有特异性依赖，所以尚需进一步进行人体试验。

1 于光艳，刘基芳，李铁骥，等.甲醛对小鼠肺组织形态及脂质过氧化物水平的影响.吉林大学(医学版)，2004，30：888-892.

2 Lin Z，Luo W，Li H，et al.The efect ofendogenous formaldehyde on the rat aorta endothelial cells.Toxieol Lett，2005，159：134-143.

3 段丽菊，朱燕，胡青莲，等.甲醛吸入效小鼠蛋白质氧化损伤作用的研究.环境科学学报，2005，25：851-854.

4 刘杰，刘宏亮，杨旭，等.气态甲醛对小鼠组织器官SOD的抑制作用.环境与健康杂志，2003，20：181-183.

5 孔祥槐，郑敏，张明霞，等.大蒜多糖B对小鼠免疫性肝损伤的干预作用.时珍国医国药，2010，21：2289-2290.