五味子醇提取物减轻丙戊酸钠肝毒性及协同抗癫痫作用研究

金 戈 于洪娟 朱美达 王俊平 郝 伟

沈阳医学院药理教研室，辽宁沈阳 110034

丙戊酸钠是临床常用的广谱抗癫痫药，具有疗效高、安全性好、很少影响患者认知功能的药效特点。但丙戊酸钠的药动学和药效学个体差异很大，剂量难以掌握。而当其血药浓度＞100 g/L时，其毒副作用增加而药效却无明显增强[1]。尤以肝脏损伤最令人关注。肝毒性主要通过抑制糖异生、抑制β-脂酸氧化、抑制细胞色素P450等主要作用使肝酶类增加[2-3]。临床资料表明，服用丙戊酸钠的患者中15%～30%在服药后出现血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）及乳酸脱氢酶等肝酶活性的升高[4-5]。五味子是多年生落叶藤本，属木兰科，可做药用。其主要保肝成分五味子乙素（Schisandrin B，Sch B），是从五味子果仁中提取的有效成分，具有显著的肝脏保护作用，是多种保肝降酶中成药的主要成分[6]。其保肝机制多认为是通过清除自由基、诱导肝细胞色素P450从而增强肝脏的解毒功能、促进肝脏蛋白质和糖原合成、改善线粒体抗氧化状态，但是确切机制尚不明确[7-8]。另有研究数据显示五味子具有明显的镇静催眠作用，这也是其中医临床用于心悸失眠的现代理论依据。其对于改善睡眠具有显著效果且不产生药物依赖性[9]，有广泛的中枢抑制作用，并有安定药的特点[10]。因此本研究旨在探讨五味子醇提取物减轻丙戊酸钠肝毒性的作用及其机制，进一步探讨五味子醇提取物协同抗癫痫的作用，为临床癫痫病的治疗提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

半自动生化仪，型号：RT1904C。酶标定量测试仪：奥地利特TECAN公司，型号：F039003。

1.2 药品及试剂

五味子醇提取物：沈阳医学院药理教研室提供；丙戊酸钠：山东仁和堂药业有限公司，批号：20090221；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化歧化酶（SOD）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。

1.3 动物

昆明种小鼠120只，体重25～30 g，健康，雌雄各半，由沈阳药科大学动物实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 实验动物分组及给药方法

实验动物40只，雌雄各半，随机分成4组：空白对照组，模型组，五味子醇提取物低剂量组（五味子低剂量组），五味子醇提取物高剂量组（五味子高剂量组），每组10只。适应性喂养3 d后，给药方式：对照组给予生理盐水；模型组给予丙戊酸钠 80 mg/（kg·d）（造模剂量预实验获得）；五味子醇提取物低剂量组给予丙戊酸钠同时给五味子醇提取物50 mg/（kg·d），五味子醇提取物高剂量组给予丙戊酸钠同时给五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；连续灌胃给药14 d。实验期间各组小鼠置于安静环境分笼饲养，自由摄食饮水，每天称量体重，观察动物进食及活动情况。

2.2 血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）含量的检测

实验动物于给药后禁食12 h。眼球采血置于带抗凝剂的EP管中，检测ALT、AST指标，评价五味子醇提取物减轻丙戊酸钠的肝脏毒性作用。

2.3 ELISA检测肝组织中GSH-Px、SOD含量

取各组肝组织100 mg，加入生理盐水900 μL，机械匀浆。静置 10 min后，4℃，3000 r/min，离心15 min后取上清液。制备标准曲线，检测肝组织中GSH-Px，SOD含量。

2.4 五味子醇提取物的协同抗癫痫作用

取小鼠80只，雌雄各半原则，随机分为模型对照组，五味子醇提取物组（五味子组），丙戊酸钠组，丙戊酸钠联合五味子醇提取物组（丙戊酸钠加五味子组）。按照组别给药：模型对照组给予生理盐水；五味子组给予五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；丙戊酸钠组给予丙成酸钠 80 mg/（kg·d）；丙戊酸钠加五味子组给予丙戊酸钠加五味子醇提取物100 mg/（kg·d），连续给药 7 d，于第 7 天经腹腔注射氯化锂（127 mg/kg），24 h 后注射硫酸阿托品（1 mg/kg），30 min 后再注射匹罗卡品（300 mg/kg）。观察小鼠出现明显的肢体阵挛、强直及跌倒等癫痫症状。按照经典的Racine癫痫发作行为标准进行癫痫的行为学评价[11]。

2.5 统计学方法

实验结果采用SPSS 17.0软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析。两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.6 结果

2.6.1 五味子醇提取物对肝酶的影响 结果显示，与空白对照组比较，模型组ALT、AST升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，五味子高剂量组ALT、AST降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组白细胞（WBC）变化不明显。见表1。

表1 五味子醇提取物处理后各组的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

表1 五味子醇提取物处理后各组的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；WBC：白细胞

组别 只数 ALT（U/L） AST（U/L） WBC（×109/L）空白对照组模型组五味子低剂量组五味子高剂量组10 10 10 10 37.40±7.62 77.01±11.38#70.30±11.05 45.60±10.54*132.80±23.02 219.60±49.94#215.70±40.01 154.60±33.46*5.98±0.31 6.00±0.26 5.94±0.21 5.98±0.24

2.6.2 五味子醇提取物对血清酶的影响 结果显示，与空白对照组比较，模型组SOD、GSH降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，五味子高剂量组SOD、GSH升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 五味子醇提取物作用后各组小鼠肝组织SOD、GSH含量变化（±s）

表2 五味子醇提取物作用后各组小鼠肝组织SOD、GSH含量变化（±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；SOD：谷胱甘肽过氧化物酶；GSH：超氧化歧化酶

组别 只数 SOD（U/mL） GSH（g/L）空白对照组模型组五味子低剂量组五味子高剂量组9999 5.47±1.14 2.63±0.79#2.99±0.71 4.50±1.16*55.97±7.41 32.68±6.85#36.26±6.60 47.53±5.11*

2.6.3 五味子醇提取物协同抗癫痫作用 结果显示，与模型组比较，丙戊酸钠加五味子组Ⅳ级、Ⅴ级动物比例明显降低（P ＜ 0.05）。 见表3。

表3 丙戊酸钠与五味子醇提取物的协同抗癫痫作用[n(%)]

3 讨论

丙戊酸钠作为临床上以应用多年的广谱抗癫痫药，可导致严重的肝损伤甚至肝衰竭[11]。其机制可能是：大量丙戊酸钠影响肝细胞正常代谢，使细胞内产生自由基及自由基样物质，产生过氧反应，进而造成肝细胞破坏和肝脏功能障碍[12]。五味子富含多种保肝成分[13]，其主要机制包括：清除肝脏代谢中产生的自由基，抑制脂质过氧化作用，进而保护肝细胞免受自由基损伤[8]。研究表明五味子对ALT升高的调节有独特作用[14]。五味子多糖明显降低老年大鼠血清丙二醛（MDA）含量，并提高老年大鼠血清SOD、过氧化氢酶（CAT）和GSH-Px活性，提示五味子多糖具有改善体内自由基代谢紊乱的作用[15-16]。Leong等[17]发现，五味子乙素能明显激活AML12细胞中ERK1/2及Nrf2，从而激活MAPK通路，最终使谷胱甘肽的表达增强，阻断氧化剂促凋亡效果。实验证明，癫痫发作时引起神经元异常放电的内向电流主要是Ca2+内流[17]，当Ca2+通道通透性增加时，Ca2+大量内流，引起神经细胞持续较长的去极化反应及阵发性去极化漂移或称爆发性放电，诱发癫痫发作。有研究报道五味子乙素可调节神经元的同步放电，抑制神经细胞内钙离子浓度[18]。五味子提取物能明显减少小鼠活动次数，有明显镇静作用。此外五味子提取物还能增加小鼠睡眠次数，延长睡眠时间[19]。为五味子的协同抗癫痫作用提供理论依据。

为了进一步探讨五味子减轻丙戊酸钠引起的肝损伤的作用，本实验采用五味子乙醇提取物连续灌胃给药后检测血清及肝组织中相应指标的方法来验证其保肝作用。结果表明测定GSH-Px的含量一定程度上可以评价肝脏损伤受到氧应激和脂质过氧化损伤的程度。五味子醇提取物可能通过增加肝组织中GSH-Px及SOD的含量产生抗氧化作用，降低血清中的AST和ALT的含量，而达到保肝的作用。另外，匹罗卡品造模致癫痫的实验显示，丙戊酸钠加五味子醇提取物组Ⅳ级以上癫痫发作的动物只数明显低于模型对照组。然而对五味子作用机制的全面阐述还有待进一步研究。

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