重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

王俊红 郭永红 张 静 徐 静 谢 璇 杨广笑 王全颖 王 枫

1.西安交通大学医学院第二附属医院内分泌科，陕西西安 710004；2.第四军医大学营养与食品卫生教研室，陕西西安 710032；3.西安交通大学医学院第二附属医院感染科，陕西西安 710004；4.西安华广生物工程有限公司，陕西西安 710025

Exendin-4是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体长效激动剂，具有与GLP-1相似的降血糖活性，目前已研发成为首个 “模仿肠降血糖素”治疗2型糖尿病的药物——Exenatide[1-2]。但是Exenatide需每日注射，对糖尿病患者的治疗很不方便[3]，并且天然Exendin-4的提取成本高，难以满足临床应用需要[4]，用基因工程方法生产前景广阔。由于Exendin-4缺乏模板，本实验利用重叠延伸PCR技术扩增出Exendin-4目的基因编码区DNA片段，成功构建了Exendin-4表达载体，为进一步利用腺相关病毒载体构建表达Exendin-4及研究其在糖尿病治疗过程中的分子作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

克隆载体 pGEM-T-Easy质粒（50 ng/μL）购自 Promega公司；大肠杆菌TOP10、E.coli DH5α菌株由西安华广生物工程公司提供。

1.2 工具酶和主要试剂

限制性内切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；质粒小提试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA回收试剂、Marker等均购自北京天根公司；引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成；其他试剂及全部实验设备均由西安华广生物工程公司提供。

1.3 方法

1.3.1 重叠延伸PCR扩增Exendin-4 cDNA[3]根据美国专利检索到Exendin-4氨基酸序列是39个氨基酸（sequence 1 from patent US 5424286 39aa），应用 DNASIS 计算机软件分析Exendin-4的开放阅读框（ORF）和它的编码子，截取39肽的编码cDNA，设计正、负向引物/模板链，正向引物的5′端设计加入NaeⅠ酶切位点，负向引物的5′端加入终止子和BamHⅠ酶切位点。通过非对称互补引物/模板（重叠）聚合酶链式反应法获得完整的Exendin-4，首先P1和P2互为引物和模板进行PCR扩增Exendin-4 cDNA核心区，以第1次PCR产物为模板，P3、P4为引物合成完整的Exendin-4，且分别在引物P3、P4中引入NaeⅠ和BamHⅠ酶切位点和终止子。引物序列见表1。PCR反应体系：在 100 μL 反应总体积中，加入 1 μL（0.1 mg/L）DNA模板，1 μL（50 μmol/L）上游引物，1 μL（50 μmol/L）下游引物，2 μL（10 mmol/L） dNTPs，10 μL 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液，80 μL消毒去离子水，最后在体系表面加50 μL石蜡油；沸水中煮 5 min 后，立即冰浴 2 min，加 1 μL（1 U/μL）TaqDNA聚合酶入反应体系。扩增条件如下：94℃预变性1 min，进入 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃延伸 5 min，32个循环；取扩增产物10 μL进行1%琼脂糖电泳，观察电泳结果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳法回收，正丁醇浓缩，酚∶氯仿抽提，无水乙醇沉淀；将沉淀溶于 20 μL TE（pH 8.0），4℃保存备用。

1.3.2 Exendin4 cDNA的T载体克隆和序列测定 将PCR产物连接到线性克隆载体pGEM Teasy中，转化Top10受体菌，氨基苄青霉素筛选阳性克隆，碱裂解法小量提取质粒，限制性内切酶EcoRⅠ酶切图谱鉴定。连接反应体系如下：①用T4 DNA连接酶连接质粒pGEM-Teasy和PCR产物，10 μL 反应体积中加入 1 μL（50 mg/L）载体 DNA，3 μL（0.5 g/L） PCR 产物，5 μL 2×T4 DNA 连接酶缓冲液，60℃水浴 5 min，冰浴 2 min，再加入 1 μL（3 U/μL） T4 DNA 连接酶，4℃水浴过夜。②用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α。③连接产物转化感受态细胞，并将转化菌在表面涂有X-gal和IPTG的琼脂平板（Amp+）上进行培养。④挑选单个白色菌落，接种于10 mL LB培养液，37℃振摇培养16 h。⑤用碱裂解法提质粒，限制性内切酶EcoRⅠ酶切分析法筛选阳性克隆，筛选到的重组子命名为pGEM-T/Exn-4。

1.3.3 核苷酸序列分析克隆基因序列 鉴定后的阳性重组质粒DNA，用T7启动子和SP6启动子作为双向测序引物，双脱氧末端终止法测定克隆基因序列。

2 结果

2.1 目的基因Exendin-4 cDNA PCR结果

以互为模板的引物进行PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所得产物与PCR Marker比较，在约136 bp处得到一条单一清晰的条带，与目的片段预期大小一致。见图1。

2.2 重组质粒pGEM-T/Exn-4酶切鉴定

构建的重组质粒命名为pGEM-T/Exn-4，大小为3015+136 bp。经EcoRⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果可见136 bp的目的片段，与理论值相符，说明Exendin-4已重组于pGEM-Teasy内。见图2。

2.3 Exendin-4的基因克隆测序结果

Exendin-4 cDNA测序结果与数据库序列经Blast比较完全一致。见图3。

3 讨论

GLP-1不仅具有降糖作用，还可以减轻体重、改善血脂，达到直接或间接的心血管保护效应[6]，但GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPP-Ⅳ）降解，体内半衰期仅为2 min左右，很难应用于临床[7]。Exendin-4是从美国西南部大毒蜥唾液中分泌的天然肠促胰岛素拟似物，具有与GLP-1相似的促进胰岛素分泌功能，其生物活性比GLP-1高5000倍左右，且DPP-Ⅳ对Exendin-4酶解作用弱，因此，Exendin-4被认为是理想的治疗2型糖尿病的新型药物。人工合成的Exendin-4（Exenatide，商品名为Byetta）是首个获准上市的肠促胰岛素拟似物[8-9]。然而，天然Exendin-4的提取成本高，难以满足临床应用需要。由于Exendin-4是一个只有39个氨基酸的短肽，体内半衰期短，稳定性差，因此，限制其在临床应用。用基因工程方法直接生产Exendin-4，表达水平低且容易降解，与载体蛋白融合表达也存在产量低、分离纯化困难等问题。为解决这一难题，本实验拟将Exendin-4 cDNA导入到分泌表达生物活性肽的专用载体，分泌表达目的蛋白Exendin-4，既可保证重组蛋白的活性又可避免原核表达高昂的生产成本。

表1 P1、P2、P3、P4 引物序列

重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来[10]。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，技术成功的关键是重叠互补引物的设计。本研究依据美国专利检索到Exendin-4为39aa，序列如下：hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlkngg pssgappps。使用DNAsis软件分析Exendin-4的ORF和它的编码子，截取编码39肽的cDNA，编辑完整的Exendin-4表达盒并使用DNAsis软件分析。由于Exendin-4是从美国西南部大毒蜥唾液中分泌的物质，没有现成的模板行PCR扩增，因此本实验利用重叠PCR技术扩增出Exendin-4目的基因，并成功构建了Exendin-4重组载体，用T7启动子和SP6启动子脱氧末端终止法测定了克隆基因序列，DNA序列测定的结果与Gen-Bank提供的已知序列比较完全一致，为进一步构建重组质粒分泌表达Exendin-4蛋白奠定了实验基础。本文方法简单可行，其结果将为利用基因工程的方法大量生产和纯化高纯度的Exendin-4提供良好基础。

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