持续抑制超氧歧化酶活性诱导大鼠慢性胰腺炎模型

朱颖 孙蕴伟 袁耀宗 张明均

·论著·

持续抑制超氧歧化酶活性诱导大鼠慢性胰腺炎模型

朱颖 孙蕴伟 袁耀宗 张明均

目的观察大鼠腹膜内注射超氧歧化酶(SOD)抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸盐(DETC)后胰腺的病理改变，并与大鼠胰管内注射三硝基苯磺酸(TNBS)所制备的慢性胰腺炎(CP)模型相比较。方法将大鼠按随机表法分为DETC组、DETC对照组、TNBS组、TNBS对照组、正常对照组。DETC组大鼠腹膜内注射DETC 750 mg/kg体重，每周2次，DETC对照组在腹腔内注射等容积生理盐水。TNBS组大鼠胰管内注入含2% TNBS的乙醇磷酸盐缓冲液，TNBS对照组注入等容积乙醇磷酸盐缓冲液。正常对照组不做任何处理。术后2、4、6、8周分批处死大鼠，取血检测淀粉酶活性，取胰腺组织行病理及超微结构检查，检测组织内SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量，免疫组化法检测组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，结蛋白(Desmin)，胶原Ⅰ、Ⅲ，TGF-β1，纤维连接蛋白(FN)的表达，RT-PCR法检测组织TGF-β1 mRNA表达。结果DETC组大鼠无死亡，TNBS组大鼠死亡率为15%。2组大鼠血淀粉酶活性差异无统计学意义。4周时DETC组大鼠胰腺纤维化评分为(3.4±1.1)分，显著高于TNBS组的(3.0±1.3)分(t=3.462，P<0.05)；6周时胰腺组织腺体破坏评分为(9.1±1.8)分，显著高于TNBS组的(8.4±1.8)分(t=2.943，P<0.05)；细胞空泡样变、脂肪浸润评分较TNBS组高，但差异均无统计学意义。DETC组和TNBS组在制模2周后即可见胰腺超微结构改变，4周后可见大量新生或已趋成熟的胶原纤维。2周时DETC组SOD活性较TNBS组显著下降(t=5.468,P<0.05)，GSH-PX活性在2、6周时较TNBS组显著下降，(t值分别为6.497，10.125,P<0.05)，而MDA活性在6、8周时较TNBS组均显著升高(t值分别为3.350，5.407，P值<0.05)。DETC组和TNBS组大鼠胰腺组织α-SMA，Desmin，胶原Ⅰ 、Ⅲ，TGF-β1和FN表达及TGF-β1 mRNA表达水平差异均无统计学意义。结论应用DETC持续抑制SOD活性可成功诱导CP。DETC组大鼠的胰腺脂肪浸润和纤维化程度较TNBS组出现得更早、更严重。采用该法制模操作简单，大鼠死亡率低，是一种较理想的制备CP模型的方法。

慢性胰腺炎； 纤维化； 二乙基二硫代氨基甲酸盐； 三硝基苯磺酸； 氧化性应激； 星形细胞

建立稳定可靠的慢性胰腺炎(CP)动物模型的方法目前主要包括利用可自发产生CP的WBN/kob大鼠加上食物或药物诱导，大鼠尾静脉内注射二氯二丁基锡(dibutyltin dichloride，DBTC)[1]，胰管结扎法，腹腔内注射雨蛙肽[2]，胰胆管内注射三硝基苯磺酸(trinitrobenenze sulfonic acid，TNBS)等[3]。雄性WBN/kob鼠国内尚无引进。静脉注射DBTC及胰管结扎法用于研究在胰胆管梗阻基础上形成的CP。雨蛙肽主要用于诱导反复发作性的急性胰腺炎(AP)。相比之下，胰胆管内注射TNBS法成模效果确切。有研究显示，氧化应激与CP发病有密切关系[4]。二乙基二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate，DETC)是一种超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性抑制剂，本研究在大鼠腹腔内注射DETC，观察是否能诱导大鼠CP的发生，并与TNBS制模法作比较。

材料与方法

一、动物模型的建立

220～250 g雄性Wistar大鼠100只购自中国科学院上海实验动物中心，通过随机表法分为DETC组、DETC对照组、TNBS组、TNBS对照组、正常对照组，每组20只。DETC组大鼠腹膜内注射DETC 750 mg/kg体重(Sigma 公司)，每周2次[5]，DETC对照组在腹腔内注射等容积生理盐水。TNBS组大鼠胰管内注入含2% TNBS的乙醇磷酸盐缓冲液，TNBS对照组注入等容积乙醇磷酸盐缓冲液。正常对照组不做任何处理。术后2、4、6、8周分批处死大鼠，取血分离血清，检测淀粉酶活性，取胰腺组织，部分用2%戊二醛或10%甲醛固定，部分置液氮保存。

二、方法

1．胰腺组织病理学及超微结构检查：取固定的胰腺组织，常规切片，包埋，行光镜及电镜检查。根据文献报道的CP的病理指标[6-7]，用改良的病理评分标准来判断纤维化程度，其中纤维化指标为叶间纤维化评分+叶内纤维化评分，腺体破坏指标为空泡样变、叶间纤维化、叶内纤维化、脂肪浸润、腺体破坏、胰岛破坏总和。

2．胰腺组织SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定：取液氮保存的新鲜胰腺组织制备组织匀浆，蛋白定量后应用SOD、MDA、GSH-PX检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测组织SOD、MDA、GSH-PX活性，按试剂盒说明书操作，用分光光度仪(Beckman公司)测定吸光度值(A值)。

3．胰腺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，结蛋白(Desmin)，胶原Ⅰ、Ⅲ，TGF-β1，纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)检测：采用免疫组化法检测。抗α-SMA、Desmin免疫组化检测盒和抗胶原Ⅰ、Ⅲ单抗购自美国Sigma公司，抗FN单抗和羊抗鼠、抗TGF-β1抗体均购自福建迈新科技有限公司，羊抗兔二抗购自Santa Cruz生物科技有限公司。 按试剂盒说明书操作。

4．胰腺组织TGF-β1 mRNA表达的检测：采用RT-PCR法检测。TGF-β1引物序列正义为5′-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′，反义为5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′，产物298 bp，以β-actin(251 bp)为内参。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。取液氮保存的新鲜胰腺组织，应用Trizol提取总RNA，先逆转录成cDNA，再行PCR扩增。PCR反应条件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 45 s(TGF-β1)或60℃ 1 min(β-actin)，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃ 10 min。PCR产物经电泳分离，摄片，扫描。以目的条带与内参条带的灰度比值表示miRNA表达量。

三、统计学处理

结 果

一、大鼠死亡率

DETC组、DETC对照组及正常对照组大鼠均无死亡，TNBS组、TNBS对照组大鼠死亡率分别为15%和10%。

二、血清淀粉酶活性

正常对照组、DETC对照组、DETC组、TNBS对照组和TNBS组大鼠的淀粉酶活性均值分别为(1661±89)、(1693±144)、(1578±195)、(1539±213)、(1501±182)U/L。各组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

三、胰腺组织病理改变

DETC诱导的大鼠4周后胰腺组织出现较为明显的纤维化，伸入腺泡，腺体结构破坏，并伴有大量炎性细胞浸润(图1a)，纤维化指标评分为(3.4±1.1)分，6周为(3.9±1.2)分，达峰值。TNBS诱导的大鼠4周后胰腺组织的管壁周围和小叶间出现大量纤维组织，胰腺结构破坏，炎性细胞浸润，并伴有脂肪浸润(图1b)，纤维化指标评分为(3.0±1.3)分，6周为(3.2±0.8)分，以后无明显加重。DETC组大鼠胰腺纤维化程度较TNBS组重，其中4周时的评分差异有统计学意义(t=3.462，P<0.05)。

DETC组6周时胰腺组织腺体的破坏评分为(9.1±1.8)分，较TNBS组的(8.4±1.8)分显著增加(t=2.943，P<0.05)。2周时DETC组空泡样变评分为(1.6±0.5)分，较TNBS组(1.0±0.5)明显； 2、4周时脂肪浸润分别为(0.9±0.7)、(2.0±1.0)分，较TNBS组的(0.2±0.3)、(1.1±0.9)分高，但差异均无统计学意义。DETC组大鼠在4周时脂肪浸润为(2.0±0.96)分，达峰值，而TNBS组在6周时达峰值。

图1DETC(a)、TNBS(b)诱导4周后的大鼠胰腺组织病理改变(HE ×400 )

四、胰腺超微结构改变

DETC组大鼠和TNBS组大鼠在诱导2周后即可见胰腺超微结构的改变。胰腺腺泡细胞内质网扩张，线粒体肿胀，嵴变短变少，间质内可见增生活跃的成纤维细胞(图2a)，有些腺泡的内质网扩张形成囊泡，有时可见腺泡细胞被破坏，释放出酶原颗粒。4周后小叶间质内可见大量新生或已趋成熟的胶原纤维，伴成纤维细胞、巨噬细胞浸润，导管扩张，导管上皮细胞增生，血管内皮增生，新生血管形成，部分腺泡线粒体肿胀，空泡样变明显(图2b)，内质网断裂解体，形成大小不等的囊泡，有些囊泡已融合成大泡。6至8周胰腺超微结构无进一步变化。正常对照组未见异常改变。

图2 DETC诱导2周后大鼠胰腺超微结构改变(×1200)

五、胰腺组织SOD、GSH-PX活性和MDA含量

DETC组各时间点大鼠胰腺组织SOD活性均较DETC对照组显著下降(t值分别为7.53，3.18，11.02，8.90，P值均<0.05)；GSH-PX活性亦均较DETC对照组显著下降(t值分别为14.74，6.55，11.54，15.01，P值均<0.05)；而MDA含量较同时间点DETC对照组显著升高(t值分别为12.93，7.63，15.86，13.17，P值均<0.05)。DETC组的SOD、GSH-PX活性和MDA含量与正常对照组的差异均有统计学意义，而DETC对照组与正常对照组的差异则无统计学意义(表1)。

TNBS组各时间点大鼠胰腺组织SOD活性均显著低于TNBS对照组(t值分别为12.71，7.89，10.03，9.16，P值均<0.05)；GSH-PX 活性在2、8周时显著低于同时间点TNBS对照组(t值分别为8.31，2.16，P值均<0.05)，其余时间点差异无统计学意义；MDA含量在2、4、6周时显著高于同时间点TNBS对照组(t值分别为7.23，4.30，7.57，P值均P<0.05)，8周时的差异无统计学意义。TNBS组及TNBS对照组胰腺组织的SOD活性、GSH-PX活性、MDA含量与正常对照组的差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

DETC组的SOD总均值、GSH-PX总均值较DETC对照组间下降49%及61%，MDA总均值较DETC对照组升高68%。而TNBS组的SOD总均值、GSH-PX总均值较TNBS对照组下仅26%及12%，MDA总均值较TNBS对照组升高6%。而且TNBS对照组SOD、GSH-PX活性较正常对照组下降，MDA含量升高。

两实验组比较，2周时DETC组SOD活性较TNBS组显著下降(t=5.468,P<0.05)，GSH-PX活性在2、6周时较TNBS组显著下降(t值分别为6.497，10.125,P值均<0.05)，而MDA活性在6、8周时较TNBS组均显著升高(t值分别为3.350，5.407，P值均<0.05)。其他时间点差异无统计学意义。

六、胰腺组织α-SMA，Desmin，胶原Ⅰ 、Ⅲ，TGF-β1和FN表达

α-SMA和Desmin的表达定位于胰腺小叶间质、血管周边和腺泡旁；TGF-β1的表达主要定位于小叶间质的结缔组织内，腺泡间也有少量表达；FN主要表达在叶间纤维组织内，呈树枝状分布；胶原Ⅰ、Ⅲ表达在腺泡之间，呈网格状包绕腺泡。

正常对照组α-SMA，Desmin和TGF-β1呈阴性或弱阳性表达，FN，胶原Ⅱ、Ⅲ呈阴性表达。DETC组和TNBS组大鼠自2周起就能在胰腺组织中检测到α-SMA，Desmin，TGF-β1的表达， 4、6、8周时无明显增强；FN及胶原Ⅰ、Ⅲ的表达在2周时呈弱阳性，4周时呈强阳性，与胰腺组织纤维化程度呈正相关。TNBS对照组α-SMA，Desmin和TGF-β1阳性表达，但FN，胶原Ⅰ、Ⅲ呈弱阳性表达(图4)。

图3DETC组大鼠2周时胰腺组织α-SMA(a)、Desmin(b)、TGF-β1(c)及TNBS组大鼠4周时胰腺组织FN(d)、胶原 Ⅰ(e)、胶原Ⅲ(f)的表达 (免疫组化 ×100，×400)

七、胰腺组织TGF-β1 mRNA表达

DETC组和TNBS组大鼠胰腺组织TGF-β1 mRNA表达水平均高于同时间点正常对照组(t值分别为10.427，11.315，9.146，9.756，8.282，10.055，14.784，7.617，P值均<0.05)，亦显著高于各自的对照组(t值分别为11.413，12.967，9.009，12.368，3.265，4.405，3.390，3.167，P值均<0.05)，但它们之间的差异无统计学意义(t值分别为0.904，0.045，-0.865，-0.017，P值均>0.05，表1)。

讨 论

慢性胰腺炎的发病机制非常复杂，目前影响较大的理论一是与乙醇相关的中毒-代谢理论，二是结石-胰管梗阻理论，三就是氧化应激理论[4]。胰胆管内注射TNBS诱导的CP是基于胰管梗阻理论，其制模效果确切，但操作难度大，手术本身有一定死亡率，注射TNBS后的死亡率更高，本研究的死亡率为15%，可见该制模方法对操作技术及术后监护要求高。相比之下，每周2次在大鼠腹腔内注射DETC操作更为简单，掌握剂量的情况下死亡率低，而且实验费用低，所需时间短，制模成功率高。

表1 各组大鼠胰腺组织SOD、GSH-PX活性和MDA含量及TGF-β1 mRNA表达

注：与各自相应对照组比较，aP<0.05；与正常对照组比较，bP<0.05

DETC是一种SOD的抑制剂，前期的实验研究结果显示[5]，大鼠腹膜内注射DETC后3 d，SOD和GSH-PX活性被抑制，而MDA活性升高，提示胰腺始终处于抗氧化酶类的过度消耗及脂质过氧化物过剩的状态下。

胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells，PSCs)具有促进胰腺纤维化发生和进展的作用[8]。活化的PSCs能表达α-SMA，能合成胶原Ⅰ、Ⅲ和FN[9]。

本研究结果显示，DETC组大鼠胰腺组织α-SMA，Desmin，胶原Ⅰ、Ⅲ，TGF-β1和FN表达增强，表明PSCs处于活性状态。本研究结果还显示，2周时DETC组胰腺组织抗氧化酶类活性低于TNBS组，腺泡细胞的空泡样变亦较TNBS组普遍，脂肪浸润和纤维化程度较TNBS组出现得更早、更严重，而且DETC组的大鼠无死亡。表明该法是一种较理想的制备CP模型的方法，特别在研究氧化应激与CP的关系有着重要的意义。

[1] Mayer JM, Kolodziej S, Jukka Laine V, et al. Immunomodulation in a novel model of experimental chronic pancreatitis. Minerva Gastroenterol Dietol, 2012，58:347-354.

[2] Li XC, Lu XL, Chen HH.α-Tocopherol treatment ameliorates chronic pancreatitis in an experimental rat model induced by trinitrobenzene sulfonic acid. Pancreatology, 2011，11:5-11.

[3] Miyauchi M, Suda K, Kuwayama C, et al. Role of fibrosis-related genes and pancreatic duct obstruction in rat pancreatitis models: implications for chronic pancreatitis. Histol Histopathol, 2007，22:1119-1127.

[4] Grigsby B, Rodriguez-Rilo H, Khan K. Antioxidants and chronic pancreatitis: theory of oxidative stress and trials of antioxidant therapy. Dig Dis Sci, 2012，57:835-841.

[5] 朱颖,孙蕴伟,翟祖康，等.氧自由基对转化生长因子β-1表达的影响及其在胰腺纤维化中的作用.胰腺病学,2005, 2:17-20.

[6] Su SB，Motoo Y，Xie MJ，et al. Antifibrotic effect of the herbalmedicine Saiko-keishi-to (TJ-10) on chronic pancreatitis in the WBN/Kob rat. Pancreas,2001，22：8-17.

[7] Matsumura N,Ochi K,Ichimura M,et al. Study on free radicals and pancreatic fibrosis-pancreatic fibrosis induced by repeated injections of superoxide dismutase inhibitor. Pancreas,2001，22：53-57.

[8] Berna MJ, Seiz O, Nast JF, et al. Benten D. CCK1 and CCK2 receptors are expressed on pancreatic stellate cells and induce collagen production. J Biol Chem, 2010，285:38905-38914.

[9] He J, Sun X, Qian KQ, et al. Protection of cerulein-induced pancreatic fibrosis by pancreas-specific expression of Smad7.Biochim Biophys Acta, 2009，1792:56-60.

Sustainedsuppressionofsuperoxidedismutaseactivityinduceschronicpancreatitisinrat

ZHUYing,SUNYun-wei,YUANYao-zong,ZHANGMing-jun.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Correspondingauthor:YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the pathologic changes in the pancreas of rats after intraperitoneal injection of DETC, a kind of superoxide dismutase (SOD) inhibitor, and to compared that with another model of chronic pancreatitis by pancreatic duct injection of TNBS.MethodsThe rats were randomly divided into DETC group, DETC control group, TNBS group, TNBS control group, normal control group. Rats in DETC group received an intra-peritoneal injection of DETC twice a week, and rats in DETC control group received an intra-peritoneal injection of same amount of normal saline. Rats in TNBS group was injected with 2% TNBS ethanol phosphate buffer into the pancreatic duct, while rats in TNBS control group was treated with injection of same amount of ethanol phosphate buffer, and rats in normal control group received no treatment. The rats were sacrificed after 2 w, 4 w, 6 w and 8 w. The serum levels of amylase were determined, and pathological and ultrastructure changes of the pancreas were measured. The levels of SOD, GSH-PX activity and MDA content were detected. The expressions of α-SMA, Desmin, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ, TGF-β1, FN in tissue were detected by immunohistochemical assay. The TGF-β1 mRNA expression was detected by RT-PCR.ResultsNo rat died in DETC group. The mortality rate of TNBS group was 15%. The serum levels of amylase were not statistically different between the 2 groups. The fibrosis scores of rat in DETC group at 4 w was 3.4±1.1, which was significantly higher than that in TNBS group (3.0±1.3,t=3.462,P<0.05). At 6 w, the damage scores of rat in DETC group was 9.1±1.8, which was significantly higher than that in TNBS group (8.4±1.8,t=2.943,P<0.05). Scores of vacuolar degeneration and fatty infiltration of rat in DETC group were higher than those in TNBS group, but the difference between the two groups was not statistically significant. Two weeks later, ultrastructure changes of pancreas could be observed, and large amounts of regenerative or mature collagen could be seen at 4 w. The SOD activity of DETC group was significantly decreased when compared with those in TNBS group (t=5.468,P<0.01). The GSH-PX activity of DETC group at 2 w, 6w was significantly decreased when compared with those in TNBS group (t=6.497, 10.125,P<0.01). While the activity of MDA at 6 w, 8 w was significantly increased when compared with those in TNBS group (t=3.350, 5.407,P<0.05). The differences at other time points were not statistically significant. The expressions of α-SMA, Desmin, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ, TGF-β1, FN, and TGF-β1 mRNA were not statistically significant between the 2 groups.ConclusionsSustained suppression of SOD activity can successfully induce chronic pancreatitis. Fatty infiltration and fibrosis in pancreas in DETC group occurs earlier with more severe presentation than that in TNBS group. Intraperitoneal injection of DETC is easy with low mortality rate, which is an ideal method for chronic pancreatitis model induction.

Chronic pancreatitis; Fibrosis; Dibutyltin dichloride; Trinitrobenenze sulfonic acid; Oxidative stress; Astrocytes

2013-01-05)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.010

200025 上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科(朱颖、孙蕴伟、袁耀宗)，消化外科(张明均)

袁耀宗，Email：yyz28@medmail.com.cn