lncRNA GAS5对雨蛙肽体外诱导急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响及机制*

许冀， 佘秋芳， 彭金娥， 汤瑜， 杨亚东**

(1.李时珍中医院 重症医学科， 湖北 蕲春 435300； 2.黄冈市中心医院 重症医学科， 湖北 黄冈 438000)

急性胰腺炎是一种较为棘手的消化系统疾病，是一种由于多种原因所导致的胰酶在胰腺内被激活后，所引起的胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症的反应，研究认为胰腺腺泡细胞的过度凋亡与急性胰腺炎有关[1-2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)能够在多个层面上发挥基因调控作用，参与多种疾病的发生发展[3-6]。生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-specific 5，GAS5)是一种lncRNA，最早被发现于鼠NIH3T3细胞，人类GAS5定位于1号染色体长臂，包含12个外显子和11个内含子，GAS5可参与肿瘤、缺氧脑损伤等病理过程[7-8]。有研究显示，在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的软骨细胞凋亡中GAS5低表达，而上调GAS5减少细胞凋亡，改善软骨细胞损伤[9]，目前尚缺乏GAS5在急性胰腺炎腺泡细胞中的研究。生物信息学软件starbase预测发现GAS5和微小RNA-135a(micro RNA-135a，miR-135a)存在结合位点。有研究表明miR-135a在急性胰腺炎腺泡细胞凋亡中发挥促进作用，沉默miR-135a可减少腺泡细胞凋亡[10]。本研究以雨蛙肽(caerulein)体外诱导急性胰腺炎腺泡细胞模型，探讨GAS5对急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响及其机制是否与miR-135a有关，为分子靶向治疗急性胰腺炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 胰腺腺泡细胞AR42J购自上海联迈生物工程有限公司。

1.1.2主要试剂和仪器 剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，C-Caspase-3)抗体(美国Cell Signaling Technology)，阴性对照载体和GAS5过表达载体(湖南普拉特泽生物)，GAS5野生型萤光素酶报告载体(GAS5 wild-type luciferase reporter vector，WT)和GAS5突变型萤光素酶报告载体(GAS5 mutant luciferase reporter vector，MUT；广州伯信)，miR-135a mimics和mimics control(山东维真)，C-Caspase-9抗体(美国Abcam)，萤光素酶活性测定试剂盒(上海翊圣)，caerulein(美国Santa)；CO2细胞培养箱(美国Precision Scientific)，LightCycler480 荧光定量PCR仪(美国Roche)，Multiskan FC酶标仪(美国Thermo)，FACS caliber流式细胞仪、PowerPac蛋白电泳仪及Gel Doc XR+凝胶显示系统(美国BD)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞转染和分组 胰腺腺泡细胞分为Control组、Caerulein组、Caerulein+Vector组、Caerulein+GAS5组、Caerulein+GAS5+miR-135a组及Caeru-lein+GAS5+miR-NC组，Caerulein组、Caerulein+Vector组及Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞分别用含有10 nm/L的caerulein培养液刺激24 h；Caerulein+Vector组、Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞分别在实验前转染阴性对照载体、GAS5过表达载体；Caerulein+GAS5+miR-135a组和Caerulein+GAS5+miR-NC组胰腺腺泡细胞分别转染GAS5过表达载体、miR-135a mimics和GAS5过表达载体、mimics control共转染后用10 nmol /L caerulein刺激24 h，细胞转染方法完全按照Lipofectamine 2000说明书进行；Control组为正常培养的胰腺腺泡细胞。胰腺腺泡细胞培养液为含有20%胎牛血清、100 mg/L链霉素及100 kU/L青霉素的F12K。

1.2.2细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)实验检测细胞增殖 各组细胞接种于96孔板内，培养24 h，加CCK-8溶液10 μL/孔，37 ℃孵育4 h；取出细胞培养板，酶标仪于490 nm波长检测吸光度(optical density，OD)值；计算细胞存活率[细胞存活率(%)=(OD对照组/OD实验组)×100%]。

1.2.3实时聚合酶链反应(realtime polymerase chain reaction，Realtime PCR)检测GAS5表达 各组胰腺腺泡细胞中添加Trizol试剂，反复吹打，充分裂解，常规方法提取细胞RNA；1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水制备TE buffer空白对照，以紫外分光光度计测定RNA；在无RNA酶的PCR管中添加Oligo(dT)1 μL和RNA 3 μg，RNase-free水补足到12 μL，65 ℃孵育5 min，置于冰上，加5×reaction buffer 4 μL、RNA酶抑制剂1 μL、dNTP mix 2 μL及M-MLV 1 μL，混合，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，cDNA于-20 ℃条件下保存；PCR扩增体系为cDNA 0.8 μL、上下游引物0.4 μL、2×Taq PCR master mix 12.5 μL，最后添加RNase-free ddH2O至25 μL；PCR反应条件为95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环，GAS5表达量计算按照2-ΔΔCt法计算，β-actin为内参。

1.2.4流式细胞术检测凋亡 各组胰腺腺泡细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中，3 000 r/min离心10 min，吸弃上清；加结合缓冲液溶液400 μL和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)溶液5 μL，于室温下结合15 min；加碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液5 μL，室温孵育20 min；流式细胞仪检测凋亡变化。

1.2.5Western blot检测C-Caspase-3和C-Caspase-9蛋白表达 各组胰腺腺泡细胞中添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，吸取溶液至离心管内，4 ℃下9 450 r/min离心10 min，吸取上清，保存于-80 ℃；按照二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)方法对蛋白样品进行定量检测；于蛋白样品中加Loading Buffer混合，煮沸5 min；配制5%浓缩胶、12%分离胶，加蛋白样品30 μg/孔，60 V电压电泳，样品进入分离胶后电压调至100 V，待溴酚蓝染料进入凝胶底部，关闭电源，取凝胶；据凝胶大小将硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)裁剪，甲醇中浸泡10 s；按常规三明治法转膜2 h(转膜电流为100 mA)，取NC膜，5%脱脂奶粉于室温中封闭2 h，加C-Caspase-3、C-Caspase-9一抗(1 ∶1 000稀释，室温孵育2 h)、二抗(1 ∶4 000稀释，室温孵育2 h)中充分结合，电化学发光液(electro chemi luminescence，ECL)显色；Quantity One分析条带的灰度值，以β-actin为参照分析C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达。

1.2.6靶基因预测及鉴定 采用生物信息学软件starbase进行靶基因预测分析，GAS5和miR-135a存在互补结合位点，以萤光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。分别在胰腺腺泡细胞中共转染miR-135a mimics和WT(miR-135a+WT组)、mimics control和WT(miR-NC+WT组)、miR-135a mimics和MUT(miR-135a+MUT组)、mimics control和MUT(miR-NC+MUT组)，培养24 h，利用萤光素酶活性测定试剂盒分析细胞萤光素酶活性变化；收集Control组、Caerulein组、Caerulein+Vector组及Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞，采用Realtime PCR法检测各组细胞中miR-135a表达，结果以U6为内参，分析miR-135a表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GAS5表达

与Control组比较，Caerulein组胰腺腺泡细胞中GAS5表达水平降低(P<0.05)；与Caerulein+Vector组比较，Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞中GAS5表达水平升高(P<0.05)。见表1。

2.2 胰腺腺泡细胞增殖和凋亡

与Control组比较，Caerulein组胰腺腺泡细胞存活率降低、凋亡率升高，细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达增多，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Caerulein+Vector组比较，Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞存活率升高、凋亡率降低，细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1和表2。

表1 各组胰腺腺泡细胞中GAS5的表达Tab.1 The expression of GAS5 in pancreatic acinar cells in each

2.3 GAS5和miR-135a的靶向关系

根据生物信息学软件对靶基因的预测，可知GAS5和miR-135a有互补结合位点。与miR-NC+WT组比较，miR-135a+WT组细胞萤光素酶活性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与miR-NC+MUT组比较，miR-135a+MUT组细胞萤光素酶活性无变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表3。

表2 各组胰腺腺泡细胞存活率、凋亡率及C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平Tab.2 Survival rate, apoptotic rate,and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 of pancreatic acinar cells in each

表3 双萤光素酶报告实验检测miR-NC、miR-135a分别与WT、MUT共转染后细胞萤光素酶活性Tab.3 Cellular luciferase activity detected by dual luciferase reporter assay after miR-NC or miR-135a co-transfected with WT , MUT,

2.4 miR-135a表达

与Control组比较，Caerulein组胰腺腺泡细胞中miR-135a表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Caerulein+Vector组比较，Caerulein+GAS5组胰腺腺泡细胞中miR-135a表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组胰腺腺泡细胞中miR-135a的表达Tab.4 The expression of miR-135a in pancreatic acinar cells in each

2.5 miR-135a mimcis的影响

与Caerulein+GAS5+miR-NC组比较，Caeru-lein+GAS5+miR-135a组胰腺腺泡细胞中miR-135a表达水平升高，细胞存活率降低、凋亡率升高，细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达增多，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图3、图4及表5。

表5 上调miR-135a对胰腺腺泡细胞的miR-135a水平、存活率、凋亡率、C-Caspase-3及C-Caspase-9蛋白表达的影响Tab.5 The effect of overexpressing miR-135a on cell survival rate, apoptotic rate,and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 in pancreatic acinar cells in each

3 讨论

急性胰腺炎是一种复杂的炎症反应性疾病，起病凶险、病死率高，部分可发展成重症急性胰腺炎，由于该病病情复杂，常累及多种组织器官，其治疗仍面临严峻挑战；深入研究其发病机制，可为急性胰腺炎的临床诊断及靶向治疗提供新的方向[11-13]。众多研究显示，lncRNA对急性胰腺炎发挥着重要调控作用，可通过影响胰腺腺泡细胞凋亡及炎症反应等影响急性胰腺炎的发生发展[14-16]。GAS5是在人体内发现较早的调控因子，可调节细胞凋亡及炎症反应，如敲低GAS5可有效抑制LPS诱导的败血症模型中的炎症和细胞凋亡[17]；敲低GAS5可保护人类心肌细胞样AC16细胞免受高糖诱导的炎症[18]；高糖处理的视网膜上皮细胞中，GAS5过表达降低了内质网应激诱导的细胞凋亡和炎症[19]。有研究发现，GAS5能够抑制炎症诱导的软骨细胞凋亡[9]。Caerulein是常见的体外研究急性胰腺炎损伤的诱导因子，受其刺激，胰腺腺泡细胞会发生过度凋亡、增殖活性降低[20]。本研究以caerulein刺激胰腺腺泡细胞，结果显示GAS5表达下调，提示GAS5可能与急性胰腺炎腺泡细胞损伤有关。Caspase-9是凋亡起始因子，Caspase-3是凋亡执行因子，其活化后能够激活细胞凋亡[21-23]。本研究进一步过表达GAS5后，caerulein诱导的胰腺腺泡细胞的存活率升高，细胞凋亡率降低，C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达减少，从而表明上调GAS5可抑制caerulein诱导的胰腺腺泡细胞凋亡，提高细胞增殖活性。因此，GAS5可能是一个胰腺炎保护因子，这对于分子靶向治疗胰腺炎具有重要意义。

已有研究表明，GAS5可通过靶向miR-135a参与动脉粥样硬化、癫痫等病理过程[24-25]。本研究结果提示，上调GAS5可靶向下调caerulein诱导的胰腺腺泡细胞中miR-135a表达水平，GAS5可通过作用于miR-135a参与胰腺炎进展。miR-135a定位于人类3号染色体，有研究表明，miR-135a在胰腺炎中表达上调，沉默miR-135a可减少caerulein诱导的胰腺腺泡细胞凋亡，降低细胞中Caspase-3的活化水平[10]。本研究在胰腺腺泡细胞中同时过表达GAS5和miR-135a后，miR-135a 可逆转GAS5对caerulein诱导的胰腺腺泡细胞凋亡的抑制作用，从而提示GAS5可能通过调控miR-135a发挥胰腺炎保护作用。

综上，GAS5可能是胰腺炎未来的治疗靶点，靶向下调miR-135a可减少caerulein诱导的急性胰腺炎腺泡细胞凋亡，然而本研究尚未对GAS5调控miR-135a的下游机制进行探讨，可考虑今后开展相关的后续研究。