竹荪多糖对砷中毒大鼠肝脏IL-6和TNF-α水平的影响*

王茂行，胡俊峰，李昌哲，左佩佩，何国志，胡婷，2***

( 1. 贵州医科大学 公共卫生与健康学院，贵州 贵阳 550025；2．贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

砷是国际癌症研究组织认定的Ⅰ类致癌物，主要以化合物形式存在，广泛分布于水和土壤中[1]；砷也是人体微量元素之一，正常情况下不会对人体造成危害。但是，砷在体内有蓄积性，砷摄入过量时极易在皮肤、指甲、毛发以及肝肾等组织和器官蓄积,造成DNA损伤、细胞凋亡、器官功能障碍导致神经系统、消化系统和皮肤等发生病变[2]。有研究发现，砷可在机体内诱发活性氧自由基促使脂质过氧化，刺激机体与肝脏损伤有关的目的基因表达，促使炎症因子的异常表达，产生炎症反应导致肝脏损伤[3]。竹荪又称竹笙、竹参，是隶属于鬼笔科竹荪属的一种食用菌。我国竹荪种类主要分为短裙竹荪、长裙竹荪、红托竹荪和棘托竹荪，其中红托竹荪和棘托竹荪主要产地在云南、贵州和湖南。竹荪成分主要包括多糖、多酚、黄酮、蛋白质等具备生物活性的物质[4]，具有健脾益胃[5]、降血脂[6]、抗凋亡[7]、抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、抗炎症[10]等保健功能。本课题在前期研究的基础上，通过建立砷致大鼠肝损伤模型，采用免疫组织化学染色的方法观察TNF-α、IL-6炎症因子在组织中的表达，评价竹荪多糖对砷中毒大鼠肝脏的抗炎性作用，为竹荪多糖的药用价值和医学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康SPF级SD大鼠，30只，体质量为80～100 g，雌雄各半，购自第三军医大学实验动物中心，合格证号SYXK(渝)2017～0002。

1.1.2主要试剂和仪器 亚砷酸钠(优级纯，美国Sigma 公司) ，竹荪多糖(本课题组采用水提醇沉法从竹荪菌托中提取，提取率 15.98 %)，一抗IL-6(ab9324)、TNF-α(ab220210)，购自abcam公司，丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)，含亚砷酸钠饲料由第三军医大学动物实验中心制备。全自动生化分析仪( AU400，OLYMPUS 有限公司，日本)，Mlilli-Q超纯水器(Millipore 公司，美国) ，μQuant Max200 超级酶标仪(Bio-Tek 公司，美国) ，Z36HK 高速冷冻离心机(Hermle 公司，德国)，ZT-12P2 组织脱水机(上海华岩仪器设备有限公司，中国)，LEICA RM2135 旋转式超薄切片机(徕卡公司，德国)，HI1220 徕卡烘片机(徕卡公司，德国) 及YT-6C 生物组织摊烤片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司，中国) 。

1.2研究方法

1.2.1实验分组 大鼠经过1周的检疫后，按体质量随机分成对照组、砷中毒组和竹荪多糖组，每组10只。对照组采用正常饲料饲养，砷中毒组采用亚砷酸钠饲料饲养(含砷50 mg/kg)，竹荪多糖组采用亚砷酸钠饲料饲养(含砷50 mg/kg)，同时在喂养第5个月后按20 mL/kg剂量，灌胃给予浓度为10 g/L的竹荪多糖溶液，1次/d，持续灌胃30 d。所有动物均自由饮水、摄食，每周称重并记录。

1.2.2大鼠肝脏脏器系数的测定 染毒结束后，大鼠禁食 12 h 称重，1% 戊巴比妥钠按照 10 mg/kg麻醉大鼠，心脏取血后，迅速分离肝脏，称重并计算肝脏系数。

1.2.3血生化检测 通过心脏取血收集非抗凝血 4 mL，3500 r/min 离心 10 min，取血清检测大鼠谷草转氨酶(AST) 及谷丙转氨酶(ALT) 水平。

1.2.4HE染色 各组大鼠肝组织标本脱水、包埋、切片、脱蜡后HE染色：苏木精3 min→流水5 min(显微镜下观察苏木精染色情况)→盐酸酒精分化3 s→水洗1 min(显微镜下观察苏木精染色情况)→伊红染色1 min→流水1 min→脱水封片，最后完成镜检。

1.2.5免疫组织化学染色 各组大鼠肝组织标本经脱水，包埋，切片、脱蜡后，置于3 %甲醇双氧水10 min，PBS 洗3次，每次5 min，转至0.01 mol/L柠檬酸缓冲液 (PH 6.0) 中，微波加热至沸腾，重复2次，冷却后经PBS洗涤，依次滴加山羊血清封闭液(室温20 min)，一抗(4 ℃过夜)，生物素化二抗(37 ℃，30 min)，PBS 水洗3次，每次5 min后DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶密封，最后镜检。

1.2.6图像采集及光密度计算 采用BA200 Digital数码三目显微摄像系统先在100倍下观察切片，再选取3个视野采集图像，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定光密度和面积，计算平均光密度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 体质量

与对照组比较，砷中毒组大鼠体质量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与砷中毒组比较，竹荪多糖组大鼠体质量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1 。

2.2 肝脏脏器系数

与对照组比较，砷中毒组大鼠肝脏脏器系数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与砷中毒组比较，竹荪多糖组大鼠肝脏脏器系数下降，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3 血清ALT、AST水平

与对照组比较，砷中毒组大鼠血清中ALT和AST的含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与砷中毒比较，竹荪多糖干预后ALT、AST均有所下降，但只有AST含量差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 肝组织学改变

HE染色结果显示，对照组的肝组织结构正常、细胞边界清晰、未见细胞坏死及炎细胞浸润增生等病理性改变；砷中毒组大鼠肝细胞边界不清，肝脏结构破坏、大量炎性细胞浸润；竹荪多糖组组织结构较正常，细胞边界清晰、排列稍有紊乱。见图4。

2.5 肝脏IL-6及TNF-α表达

2.5.1IL-6的表达 如图5所示，对照组大鼠肝脏中IL-6少量分布于细胞间质；与对照组比较，砷中毒组大鼠肝脏内细胞质和间质间均呈黄棕色，IL-6的表达水平增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与砷中毒组比较，竹荪多糖组细胞质和细胞间质呈黄色，IL-6的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5.2TNF-α的表达 如图6 所示，TNF-α蛋白在对照组大鼠肝脏中表达水平较低。与对照组比较，砷中毒组大鼠细胞质和细胞间质呈黄棕色，均呈现TNF-α的阳性表达，TNF-α表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与砷中毒组比较，竹荪多糖组大鼠肝脏中TNF-α蛋白的表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

砷中毒临床上以多脏器多系统损害为特点，并可最终发展为皮肤癌、肺癌、肝癌等[11]。流行病学调查显示，肝脏是砷在机体发挥毒性的主要靶器官之一，但具体作用机制不明，且无特效治疗药物，限制了砷的防治工作进展[12]。因此，深入探索砷致肝损伤的发病机制，寻找切实有效的早期诊断标志物和生物治疗靶标是目前防治砷暴露所致肝损伤的重要任务。现有学说已证实砷中毒诱导的肝脏损伤与炎症的发生密切相关[13]。竹荪，是我省资源丰富的药食两用真菌，富含维生素、蛋白质、多糖等活性物质[14]。近年来发现其提取多糖具有调节免疫，抗肿瘤、抗氧化、降血脂、血糖等活性[11, 15-17]，在医药、食品方面具有巨大的开发利用价值，是天然活性物质研究相关领域的热点。

本研究通过利用亚砷酸钠建立砷中毒大鼠肝组织损伤模型，以竹荪多糖进行干预。根据大鼠体质量变化显示，砷可以抑制大鼠体质量的增加，而竹荪多糖干预后在一定程度上改善了大鼠体质量的下降。检测血清中ALT和AST的含量显示，砷暴露后大鼠血清中AST、ALT含量相较对照组均升高，提示肝脏发生损伤，而竹荪多糖干预后，降低了AST、ALT的含量，损伤得到缓解。以HE染色观察肝损伤情况，结果显示，砷暴露引起肝组织结构的破坏，引发炎细胞浸润增生，竹荪多糖可以在一定程度上改善损伤情况。以上结果均表明，我们利用亚砷酸钠成功诱导大鼠肝损伤模型，竹荪多糖干预可拮抗砷对肝脏的损伤作用。

肿瘤坏死因子(TNF-α)又称恶液质素，是 B 细胞和单个吞噬细胞产生的一种生物活性细胞因子，参与许多生理和病理过程，如免疫、抗炎、抗感染、抗肿瘤，可直接杀死癌细胞，其具备强大的抗癌能力[18]，但因具有严重毒副作用未能应用于抗癌药物的研发。其可诱导细胞产生IL-6、IL-1，增加肿瘤坏死因子自身表达损害机体组织[19]。IL-6是一种功能广泛的多效性因子具有调节细胞生长、分化以及参与机体免疫调节，在机体抗感染免疫反应中有至关重要的作用[20]。在产生炎症反应过程中IL-6会快速生成，临床上手术病人的IL-6浓度能够预测是否会伴随并发症的产生[21]。

在机体正常情况下细胞因子TNF-α、IL-6的表达、分泌受到机体的严格调控维持在正常水平并发挥免疫调节功能，炎症反应作为一种抵抗外来物对机体刺激的主要方式，对维持机体的正常功能有着重要作用，当外来物刺激机体或产生病变时，机体不能及时产生炎症反应或者机体炎症反应过度都可对机体产生严重损害，表现为癌症在内的多种疾病。本研究通过组织免疫化学法检测大鼠肝脏中炎症因子TNF-α及IL-6的表达，结果显示，砷暴露上调大鼠肝组织中TNF-α、IL-6的蛋白表达，而竹荪多糖可以拮抗TNF-α、IL-6的上调。说明砷暴露打破了机体炎症平衡，可能通过改变TNF-α和IL-6的蛋白表达激发机体发生炎症反应，继而导致肝脏损伤，而竹荪多糖可以通过抑制TNF-α和IL-6蛋白的上调，发挥保护肝脏的作用。

综上所述，砷暴露可以诱导大鼠肝脏损伤，这种损伤可能与其激发炎症反应有关，而竹荪多糖可以通过下调肝脏中炎症因子TNF-α和IL-6的表达发挥一定的保护作用，但竹荪多糖具体的抗炎机制还有待进一步深入探索。