雷帕霉素对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压及肺血管重构的影响

刘 杰 杜雨轩 王 望 国 桓 王 军* 王 辰

(1.首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京100069;2.北京市呼吸和肺循环疾病重点实验室，北京100020;3.卫生部北京医院，北京100730)

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是由不同病因所导致的，以肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高为特点的，以肺血管重构为主要病理特征的一组综合征［1］。目前针对肺动脉高压的治疗以舒张血管为主，从而起到缓解症状，改善运动耐量的作用，但这些药物并不能从根本上有效的抑制或者逆转肺血管重构［2］，进而阻止肺动脉高压的发生与发展。

雷帕霉素(rapamycin)是一种具有抗肿瘤细胞增生、抗免疫作用的大环内酯类抗生素［3］。它通过与细胞内的FK506结合蛋白12(FK506-binding protein 12，FKBP12)结合并形成复合物后，进而与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)相互作用，抑制DNA和蛋白质的合成，导致G1期细胞周期阻滞，从而抑制细胞的增生［4-5］。

因此，本文的目的在于探讨雷帕霉素是否可以通过抑制肺血管壁细胞异常增生从而干预肺动脉高压的发生与发展，进而为肺动脉高压的预防和治疗提供新的靶点与思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1)实验动物及分组:雄性健康成年SD大鼠28只，购自首都医科大学〔实验动物许可证号:SCXK(京)2006-0009〕，体质量300 g左右，采用抽签法将动物随机分为3组(对照组、野百合碱组和雷帕霉素干预组)，每组又分为3个时间点，即0周(n=4，由于0周时各组尚未做任何处理，因此3组共用一组实验动物)，2周(n=4/组)和4周(n=4/组)。① 对照组(control组)(n=4:实验开始第1天腹腔注射0.9%氯化钠注射液1次;②野百合碱组(monocrotaline组，MCT组)(n=12):实验开始第1天腹腔注射MCT(60 mg/kg)1次;③雷帕霉素干预组(rapamycin组)(n=12):于MCT腹腔注射前1 d给予rapamycin(2 mg/kg)腹腔注射，随后隔天注射，3 次/周。

2)主要试剂配制及系统:MCT购自美国Sigma公司(将MCT溶于1 mol/L HCl后，用1 mol/L NaOH调整pH为7.4，用0.9%氯化钠注射液调整其终浓度为10 g/L)，雷帕霉素购自华北制药集团(用无水乙醇将雷帕霉素配制成浓度为30 g/L的储液，用含0.25%聚乙二醇400(PEG-400)和0.25%吐温20(Tween-20)的溶液将储液稀释为0.6 g/L的工作液)。PEG-400购于北京化学试剂公司，Tween-20购于鼎国昌盛生物技术有限责任公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1)右心室收缩压及右心室肥厚指数的检测:分别在实验的0、2、4周将各实验组动物用2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉，并用250 U的肝素抗凝后，行右心导管插入术检测右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)。分离出大鼠心脏，剪掉心耳，沿室间隔剪下右心室，分别称量右心室(right ventricle，RV)、左心室+室间隔(left ventricle plus interventricular septum，LV+S)的质量，计算 RV/(LV+S)×100%，即右心室肥厚指数(the index of right ventricular hypertrophy，RVHI)。

2)肺组织病理切片:将各实验组动物的肺组织固定于4%中性甲醛，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，做4 μm/张的连续切片，进行HE染色。应用Image-Pro Plus 5.1病理图像分析系统测定各实验组动物肺小动脉管壁的血管外周长(中膜以内)和血管腔周长(内膜表面以内)。依据公式:①中膜厚度=血管外周长/2π－血管腔周长/2π;② 血管壁中层横截面积=血管外周长2/4π－血管腔周长2/4π;③血管壁中层厚度占外径百分比(media thickness%，MT%)=(中膜厚度×2)/(血管外周长/π)×100%;④血管壁中层横截面积占血管总横截面积百分比(media cross-sectional area%，MA%)=血管壁中层横截面积/(血管外周长2/4π)×100%。本实验主要研究外径在150 μm以下的肺细小动脉，每只大鼠检测5～10根血管，每组检测3只大鼠。

1.3 统计学方法

使用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析。计量数据以均数±标准误(ˉx±SE)表示，采用3×3析因方差分析，组间均数比较采用LSD。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况及体质量变化

对照组大鼠毛发光亮，体质量随时间增加。MCT组大鼠毛发灰暗，活动度降低，体质量明显减轻，胸腔积液，肝脏淤血，肺脏瘀斑，心脏增大。雷帕霉素干预组体质量显著降低，未见其他异常。与对照组相比，野百合碱组大鼠2周时体质量即出现明显降低〔(369.75 ±2.14)g vs(393.55 ±10.09)g，P ＜0.05〕，4 周时降低更加显著〔(377.78 ±15.49)g vs(452.33±9.52)g，P ＜0.01〕。雷帕霉素干预组与野百合碱组相比，体质量进一步降低，2周时为〔(282.70±6.61)g vs(369.75 ±2.14)g，P ＜0.01〕，4 周时为〔(311.20±3.80)g vs(377.78 ±15.49)g，P ＜0.01〕(图 1)。

图1 各组大鼠体质量Fig.1 Comparison of body weight among the groups

2.2 大鼠RVSP的改变及雷帕霉素的干预作用

对照组大鼠的RVSP在实验期间无明显变化。但野百合碱组大鼠自2周起RVSP即明显高出对照组(47.62 ±15.04)%，至4 周时已经高达(45.40 ±3.53)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。雷帕霉素干预组大鼠的RVSP尽管在各时点仍高于对照组，但与MCT组比较已明显降低。在2周和4周时分别降低(17.04±3.52)%和(20.88 ±5.00)%。如表1 所示，雷帕霉素干预显著地抑制了野百合碱诱导的大鼠RVSP的升高。

表1 各组大鼠右心室收缩压Tab.1 Comparison of RVSP among the three groups(ˉx±SE，mm Hg)

2.3 大鼠RVHI的改变及雷帕霉素的干预作用

对照组大鼠的RVHI在各时点差异无统计学意思。但MCT组大鼠自2周起RVHI即显著地高出对照组(16.69±2.48)%，4周时 RVHI继续增加达(55.96±1.96)%。雷帕霉素干预组大鼠尽管在4周时的RVHI仍高于对照组，但与野百合碱组相比，RVHI显著降低。2周时雷帕霉素干预组大鼠RVHI较野百合碱组降低(13.70±4.72)%，4周时降低(36.69±2.62)%。雷帕霉素显著地抑制了野百合碱诱导的大鼠RVHI的增加，详见表2。

表2 各组大鼠右心室肥厚指数Tab.2 Comparison of RVHI among the three groups(ˉx±SE，%)

2.4 大鼠肺血管重构及雷帕霉素的干预作用

对照组大鼠肺腺泡内肺动脉管壁较薄，管腔正常。与对照组相比，野百合碱组大鼠肺腺泡内肺动脉管壁增厚程度显著增加，管腔狭窄，并且随着时间的延长，病理变化更加明显。雷帕霉素干预组大鼠腺泡内肺动脉结构清晰，形态基本正常(图2)。因肺动脉高压血管壁重构主要发生在血管中层，因此本研究用血管壁中层厚度占外径百分比(MT%)，血管壁中层横截面积占血管总横截面积百分比(MA%)作为衡量肺血管重构的指标。与对照组相比，野百合碱组大鼠MT%、MA%都增加(P均＜0.01)。与野百合碱组相比，雷帕霉素干预组大鼠MT%、MA%都降低(P均＜0.01)。如表3所示，雷帕霉素干预显著地抑制了野百合碱诱导的大鼠肺血管的重构。

3 讨论

本研究采用一次性腹腔注射野百合碱的方式，成功地复制出肺动脉高压大鼠模型。与对照组相比，野百合碱组大鼠肺动脉压力、右心室肥厚程度显著增加，肺小动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄。与野百合碱组相比，雷帕霉素干预组大鼠肺动脉压力、右心室肥厚程度显著降低，肺小动脉血管壁未见明显增厚。雷帕霉素的早期使用有效干预了野百合碱所诱导的大鼠肺动脉高压及肺血管重构的形成。

肺动脉高压是一种以肺血管收缩、血管壁重构以及原位血栓形成为病理特点的，许多相关因子参与［6］的以肺血管壁各层细胞增生为显著特征的致命性疾病。根据肺动脉高压的病理机制，临床上针对肺动脉高压的治疗药物主要通过3种途径发挥作用:内皮素途径、一氧化氮途径以及前列环素途径。然而其5年生存率仍仅为50%［7］。另外，由于受到药物自身药代动力学的影响，这些药物的使用范围受到了广泛的限制［8］。因此，探索一种方便、安全、长效的抑制血管壁细胞增生的药物成为当今治疗肺动脉高压的重点与热点。

图2 各组大鼠肺组织HE染色Fig.2 Sections of the lungs were stained with HE

表3 各组大鼠MT%、MA%Tab.3 Comparison of MT%，MA%of small pulmonary arteries among the groups(ˉx±SE，n=15～30)

在心血管系统中，雷帕霉素能够有效的抑制生长因子刺激的血管内皮细胞、平滑肌细胞［9］以及成纤维细胞［10］的增生，因此雷帕霉素药物洗脱支架安全有效的防止了冠状动脉支架放置术后新生内膜形成引起的再狭窄［11］。雷帕霉素亦能有效的抑制生长因子等诱导的mTOR/p70S6K信号通路的活化，从而抑制肺血管壁细胞的生长与增生［12-14］。同时，雷帕霉素也可能通过抑制库容性钙离子内流(store operated Ca2+entry，SOCE)，降低细胞内的Ca2+浓度，从而有效的抑制慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者平滑肌细胞的增生［12］。雷帕霉素还可通过上调肺动脉内皮细胞以及平滑肌细胞内的血红素加氧酶，来抑制肺动脉内皮细胞以及平滑肌细胞的增生［15］。另外，雷帕霉素可通过上调KLF4/p27的蛋白表达［16］，抑制平滑肌细胞的增生。可见，雷帕霉素可以通过调节不同的信号通路，抑制血管壁各层细胞，尤其是血管壁平滑肌细胞的增生，但其确切的作用机制，目前尚不清楚。

本研究尚存在许多不足，首先是只使用了单一剂量的雷帕霉素，并没有检测不同剂量的雷帕霉素对于野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的影响。本研究中，雷帕霉素干预组大鼠的体质量明显低于对照组以及野百合碱组，这可能与药物的使用剂量有关。其次，本实验也没有研究雷帕霉素对于野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的逆转作用。再次，关于雷帕霉素发挥保护作用的机制还有待于进一步深入的研究。

总之，本研究通过在体实验证实雷帕霉素可有效干预野百合碱所诱导的肺动脉高压大鼠的血流动力学、右心室肥厚程度以及肺血管重构情况。雷帕霉素有可能通过抑制肺动脉平滑肌细胞的增生，从而干预了肺血管壁的重构以及肺动脉高压的形成，从而为临床上预防和治疗肺动脉高压提供了新的靶点与思路。

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