5种不同遗传背景绿色荧光蛋白(GFP)基因导入系小鼠的培育

吴培林,俞利平,尹洪萍,杨伟伟,顾美儿,刘桂杰,张艳丽,李高天,吴宝金

(杭州师范大学实验动物中心,浙江 杭州 310036)

5种不同遗传背景绿色荧光蛋白(GFP)基因导入系小鼠的培育

吴培林,俞利平,尹洪萍,杨伟伟,顾美儿,刘桂杰,张艳丽,李高天,吴宝金

(杭州师范大学实验动物中心,浙江 杭州 310036)

通过反复回交——筛选目的基因的手段,将C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠的绿色荧光蛋白基因(GFP)分别向BABL/C、CBA/J、DBA/2J、AKR/J、FVB/J等品系小鼠导入,得到了5种不同遗传背景且带有GFP基因的导入系小鼠.冰冻组织切片等方法显示GFP导入系小鼠的皮肤、肝、肾、心、肺等均有不同程度的绿色荧光蛋白表达,不同遗传背景对GFP的组织表达谱、血液生理指标及繁殖性能未见影响.本实验采用基因导入法培育了5种新的带有GFP导入系小鼠,这些不同遗传背景的基因导入系小鼠为移植生物学研究提供了材料.

绿色荧光蛋白;基因导入;表达谱

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是从水母中提取的能发出绿色荧光的蛋白质,它无需作用底物或共作用物,在荧光激发下可以直接发光[1-4].GFP性质稳定,可在多种异源生物中表达且无细胞毒性,作为优良的生物示踪材料被广泛用于生物医学研究.C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J(杰克逊实验室,The Jackson Lab,的品种编号为004353)是一种C57BL/6(B6)背景,GFP表达水平最高及使用最广泛的转基因小鼠之一,被用于组织细胞移植方面的研究(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同品系小鼠可能具有不同H-2复合体的遗传背景,而只有在相同H-2复合体的近交系小鼠间进行器官组织或细胞系移植,才能最大限度消除免疫系统对移植的排斥效应.近交系有约450种[5],常用近交系近10余种,B6背景的GFP小鼠远远不能满足移植生物学的需求,培育不同H-2复合体遗传背景且表达GFP的小鼠品系非常必要.本实验以C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠为基础,通过反复向特定品系交配并在后代筛选GFP基因的方法,将GFP基因导入国内常用的近交系小鼠中,培育了5种表达GFP基因的导入系小鼠.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及饲养环境

C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J小鼠从美国杰克逊实验室引进,DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J 5种近交系小鼠由杭州师范大学实验动物中心提供,所有小鼠均为清洁级,实验动物生产许可证:SCXK(浙)2011—0048,实验动物使用许可证：SYXK(浙)2011—0157.所有小鼠饲养在屏障动物房内,温度控制在(23±2)℃,湿度控制在(55±5)%,饲料采用Co60照射,自由采食和饮水,定期更换笼具、垫料(均经高温灭菌),室内照明采用12/12 h明暗交替.

1.1.2 实验试剂及仪器

PCR相关试剂和引物由上海生物工程有限公司提供;相关仪器有：德国MicRom HM550冰冻切片机,NIKON ECLIPSE 80i荧光显微镜,美国HEMAVET 950血常规分析仪,美国Caliper IVIS Kinetic小动物活体成像系统,BIOS1000 PCR仪,TANON EPS300电泳仪,Tamon2500数显凝胶成像系统等.

1.2 实验方法

1.2.1 GFP导入系小鼠的培育

将C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J纯合子小鼠分别与DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J共5种近交系小鼠配种,建立5个繁殖体系,每一繁殖体系的后代小鼠用PCR结合紫外光照射方法检测是否携带GFP基因.选择GFP阳性小鼠继续向希望导入的背景品系回交.如此反复回交10代以上.各繁殖体系在每一代小鼠中均保留6～8对,保证每个繁殖体系不断代,培育过程中,除用于繁殖的个体,其余小鼠淘汰.

1.2.2 GFP纯合子导入系的培养及确认

在得到不同近交系背景GFP杂合子小鼠的基础上,将各繁殖体系的GFP杂合子互交,理论上后代小鼠中有1/4为GFP纯合子小鼠.将检测对象再次与背景品系交配繁殖15只以上子代小鼠,若所有子代全部带GFP基因或表达GFP,则检测对象为纯合子,若后代仔鼠中有一只正常小鼠则淘汰检测对象.选择纯合子互交,保种.

1.2.3 GFP阳性小鼠筛选

1.2.3.1 荧光观察及确认

在各个繁殖体系中,将GFP阳性小鼠回交背景品系得到的后代小鼠置于暗室内,用手提式紫外灯照射或小鼠活体成像仪下拍照观察有无绿色荧光的发生,有绿色荧光的小鼠保留,没有发绿色荧光的小鼠淘汰.发绿色荧光的小鼠与对照小鼠分别用CO2麻醉后,置小动物活体成像仪于480 nm条件下拍摄.

1.2.3.2 PCR扩增确认

剪取小鼠尾部组织约0.5 cm,酚氯仿法提取DNA,采用DNAStar软件设计一对GFP引物：P1:5’-TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG-3’,P2:5’-CGGCGGCGGTCACGAACTC-3’.20 μL反应体系,10×buffer2.0 μL,Mg2+(25 mmol/L)1.6 μL,dNTP(10 mmol/L)0.25 μL,上下游引物(50 uΜ/L)各0.25 μL,Taq酶(50 IU)0.25 μL,DNA模板1 μL,加蒸馏水至20 μL.94 ℃5 min预变性,94 ℃30 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s,30个循环,72 ℃延伸10 min,16 ℃保存.4%琼脂糖凝胶电泳,紫外等条件下拍照观察.

1.2.4 GFP导入系小鼠的表型分析

1.2.4.1 GFP组织表达检测

取GFP导入系5种不同背景的4 W龄纯合子小鼠,5%的水合氯醛麻醉后处死,分别取心、肝、肺、皮肤、脑等不同的组织,置于冰冻切片机急速冷冻后行连续切片,于荧光显微镜下观察,同时设背景品系作为对照.

1.2.4.2 血常规检测

取4周龄GFP导入系小鼠和相应背景小鼠雌雄各8只,眶静脉采血约200 μL,置于含有K2-EDTA抗凝剂的指形管中颠倒混匀,动物血液分析仪进行血常规检测.

1.2.4.3 繁殖性能检测

各繁殖体系6～8 W龄GFP导入系小鼠1∶1交配各6对,分别记录各繁殖体系小鼠的产仔数与胎间隔日期,同时设背景品系作为对照.

2 结 果

2.1 获得5种不同遗传背景的基因导入系小鼠

本实验成功将C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J与DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J分别交配,建立了5个基因导入繁殖体系.在各繁殖体系的后代中筛选GFP阳性小鼠后向同一品系回交,几种繁殖体系均未出现繁殖中断现象,经10次回交后,获得5种GFP阳性的导入基因杂合子小鼠.随后将GFP杂合子互交得到带有GFP基因的纯合子小鼠,依据基因导入系命名规则,将5种GFP基因导入系小鼠分别命名为B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP(如图1),这几种基因导入系小鼠的H-2复合体类型与各自的背景品系一致,分别为H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.将成年鼠和新生鼠在紫外下观察,可以看到明显的绿色荧光,在小动物成像仪中可清晰分辨出阳性GFP小鼠.在自然光源下,白色被毛红色眼GFP小鼠可看到眼球明显呈绿色,有色小鼠则无法分辩.GFP阳性小鼠荧光检测与PCR检测结果一致,发绿色荧光的小鼠均可见扩增得到250 bp左右的目标条带(如图2).

A.GFP转基因小鼠在小动物成像仪下拍摄图片;B.B6.D2-GFP;C.B6.CB-GFP;D.B6.FVB-GFP;E.B6.C-GFP;F.B6.AK-GFP.每幅图片右侧为GFP基因导入小鼠,左侧为背景对照.动物成像仪可以显著区分阳性小鼠,肉眼可见GFP阳性白色被毛小鼠眼睛呈淡绿色,无法分辨有色小鼠GFP是否表达.

注：1、3、5、7、9、11泳道分别为对应的各背景品系小鼠DNA样本;2、4、6、8、10、12泳道分别为C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J，B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP小鼠的DNA样本.

2.2 基因导入系小鼠的表型特征

2.2.1 组织表达谱分析

荧光显微镜下观察发现,5种基因导入系小鼠GFP在各种类型组织细胞中的表达情况均与亲本C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠一致：GFP在心、肝、肺、肾、表皮、胃肠壁、白细胞及血小板组织细胞中表达较强,在皮下组织、脑组织、脂肪细胞、脉络膜及巩膜内面低表达,在红细胞几乎不表达.不仅如此,在肝、脾等组织中,GFP在细胞间质的聚集量显著高于细胞内,而心肌、肾小管等细胞内外GFP含量一致.背景品系对应组织细胞中无绿色荧光蛋白的表达(如图3).

注：A.血涂片;B.眼球壁;C.耳廓皮肤;D.心肌;E.肝;F.肾;G.脑;H.脾;I.GFP阴性小鼠肝组织.

2.2.2 血常规结果分析

经t检验统计比较,5种导入系小鼠与背景品系的各项指标未发现显著性差异(结果未显示).显示GFP基因对小鼠的血细胞发育无显著影响.

2.2.3 繁殖性能比较

各GFP导入系小鼠与相应的背景品系的产仔个数(P1)和胎间隔天数(P2)比较,P值均大于0.05,无显著性差异,说明GFP基因对小鼠的繁殖性能无显著影响(见表1).

表1 小鼠繁殖学指标对比

3 讨 论

3.1 关于同源基因导入法

通过反复回交——筛选的基因导入法是培育动植物新品系的经典手段.Snell利用这一方法将一种近交系小鼠中的肿瘤抗性基因导入另一易感肿瘤的近交系小鼠中,使后者获得肿瘤抗性,并借此发现了小鼠的主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen,MHC)即H-2系统[6].通过基因导入培育的近交系被称为同源导入近交系(congenic inbred strain),通常指2个以上品系之间有少部分基因不同而其它基因都相同的近交系小鼠.采用这一方法,将同一基因导入不同遗传背景,以比较同一基因在不同遗传背景中的功能差异;可以将某基因不同的等位基因导入一个相同的遗传背景中,比较不同等位基因在相同遗传背景下的不同效应;也可以将封闭群中发现的突变表型导入近交系,纯化特定基因的遗传背景,继而方便对突变基因的定位鉴定[7-8].

李振林等[9]用显微注射的方法建立新生血管的内皮中有绿色荧光蛋白(GFP)表达的转基因小鼠,徐艺玫等[10]通过精子载体法将GFP基因导入KM小鼠体内,这些实验方法虽然都取得了成功,但实验过程比较复杂繁琐,技术要求较高.相对于转基因及基因敲除等遗传工程手段,基因导入法操作及技术要求简单,研究者针对感兴趣的表型或特定的染色体片段,在普通实验室就可以开展相关工作,实验结果稳定可靠,其缺点是耗时长.本文采用基因导入法,经过近3年的工作,最终成功培育了B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP近交系背景共5种GFP基因导入系小鼠.不同于B6小鼠的H2b,这些小鼠的MHC类型分别是：H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.

3.2 GFP导入系小鼠的生物学特征

本实验培育的5种GFP基因导入系小鼠,其GFP表达水平与亲本小鼠没有差别,器官组织的表达谱一致,且对血液生理及生殖能力均无明显影响,说明遗传背景差异不影响GFP表达,且GFP对小鼠无显著毒副作用.通过对GFP导入系小鼠的表型分析,我们认为两个问题值得注意:一是各种组织中的表达量有显著差异,只有较高表达水平的组织细胞才适合作为移植供体使用;二是在部分组织细胞内,如肝脏、脾等,GFP表达后被输送到细胞间质,细胞内GFP含量相对较少,这在移植实验中应该给予足够重视.对这些导入系小鼠而言,深入开展组织细胞表达谱的工作非常重要,可以为移植生物学供体选择提供更多信息.

3.3 GFP导入系小鼠的应用价值

表达GFP的转基因小鼠是荧光成像系统的重要动物模型,为干细胞的分化与定位、免疫细胞与肿瘤细胞相互作用等移植生物学研究提供了有力的工具动物和影像学技术手段[11].全世界现有近交系小鼠450多种[5],其中常用品系约10余种,尽管表达GFP的转基因小鼠有很多,但他们的背景品系仅有C57BL/6J、129、STOCK等少数几种(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同近交系小鼠间H-2复合体差异性的限制,GFP供体小鼠的缺乏在一定程度上影响着移植生物学的发展.比如鲁文果[12]曾经在不同品种动物间进行细胞移植的尝试,因供体组织与受体动物主要组织相容性抗原不同,供体组织细胞的发育与迁徙必然受到很大影响.本实验培育的5种GFP基因导入系小鼠,是以国内外常用近交系小鼠为背景自主培育的,为移植供体提供了更多的选择余地.另一方面,C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转GFP基因小鼠是从美国杰克逊实验室引进的,按照引进协议,这种小鼠只能被用于纯粹的科学研究,禁止用于商业目的的开发.本实验培育的5种GFP基因导入系小鼠避开了从国外引进小鼠带来的知识产权问题,对移植生物学研究也具有重要的意义.

[1] Jackson S E, Craggs T D, Huang J R. Understanding the folding of GFP using biophysical techniques[J]. Expert Rev Proteomics,2006,3(5):545-559.

[2] Wolff M, Kredel S, Wiedenmann J,etal. Cell-based assays in practice: cell markers from autofluorescent proteins of the GFP-family[J]. Comb Chem High Throughput Screen,2008，11(8):602-609.

[3] 汪恒英,周守标,常志州,等.绿色荧光蛋白(GFP)研究进展[J].生物技术,2004,14(3):70-73.

[4] 吴瑞,张树珍.绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用[J].分子植物育种,2005,3(2):240-244.

[5] Beck J A, Lloyd S, Hafezparast M,etal. Genealogies of mouse inbred strains[J]. Nature Genetics,2000,24(1):23-25.

[6] Snell G D. Methods for the study of histocompatibility genes[J]. J Genet,1948,49(2):87-108.

[7] Markel P, Shu P, Ebeling C,etal. Theoretical and empirical issues for marker-assisted breeding of congenic mouse strains[J]. Nat Genet,1997,17(3):280-284.

[8] Ikegami H, Fujisawa T, Makino S,etal. Congenic mapping and candidate sequencing of susceptibility genes for Type 1 diabetes in the NOD mouse[J]. Ann N Y Acad Sci,2003,1005:196-204.

[9] 李振林,高毅,贾俊双,等.新生血管可视化转基因小鼠的建立[J].南方医科大学学报,2011,31(10):1748-1752.

[10] 徐艺玫,燕顺生,侯岩岩,等.绿色荧光蛋白在KM小鼠体内的表达[J].中国比较医学杂志,2006,16(11):658-660.

[11] Garofalakis A, Meyer H, Zacharakis G,etal. 3d in vivo imaging of gfp-expressing t-cells in mice with non-contact fluorescence molecular tomography[C].Proc.SPIE6143, Medical Imaging 2006: Physiology, Function, and Structure from Medical Images,61431H,doi:10.1117/12.657380.

[12] 鲁文果.GFP+小鼠胚胎干细胞ESD3大鼠脑内移植的相关研究[D].武汉：华中科技大学,2006.

BreedingFiveKindsofCongenicMicewiththeGreenFluorescentProteinGene

WU Peilin, YU Liping, YIN Hongping,YANG Weiwei, GU Meier,LIU Guijie, ZHANG Yanli, LI Gaotian, WU Baojin

(Laboratory of Experimental Animal Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Using the method of repeated backcrossing and screening target gene, the experiment introduced the green fluorescent protein (GFP) gene of C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J mouse into five different inbred strains including BABL/C, CBA/J, DBA/2J, AKR/J, and FVB/J respectively, and finally obtained B6.D2-GFP, B6.CB-GFP, B6.FVB-GFP,B6.C-GFP and B6.AK-GFP congenic mice with the GFP gene. Frozen tissue sections showed that GFP was, in different degree, expressed in tissues like skin, liver, kidney, heart and lung, etc. Different genetic background had no effect on the expression profile of GFP, the blood physiological parameter and reproductive performance. Five kinds of congenic mice with GFP bred in this experiment provide donor materials for the researches of transplantation biology.

green fluorescent protein(GFP); congenic mouse; expression profile

2012-10-15

杭州市重点实验室项目(20100333T06);国家自然科学基金项目(31071092);浙江省卫生厅科技项目(2009A160).

吴宝金(1969—),男,教授,博士,主要从事人类疾病小鼠模型及分子遗传学研究.E-mail: baojinwu@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.01.002

Q95-33

A

1674-232X(2013)01-0008-06