肠炎沙门氏菌在鲜切果蔬中的动态生长变化*

罗婵，陈安均，崔慧玲，蒲彪，敖晓琳

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

鲜切果蔬通常被消费者认为是较为安全的食品，但由于缺少更多的加工处理，因此也存在潜在的安全问题［1］。随着鲜切果蔬消费量逐年增加，因食用新鲜果蔬及鲜切果蔬而引起的食源性疾病的爆发也愈加频繁［2］。1996 年到2008 年期间，美国有82 起食源性疾病的爆发与食用鲜切产品有关，其中34%与消费绿叶类蔬菜有关，引起949 人患病，5 人死亡［3］。农田灌溉、清洗用水、动物、用城市污水制作的肥料、带菌的工人及不卫生食品生产设备都是病原菌污染的来源，与鲜切果蔬相关的病原菌主要包括Escherichia coliO157:H7，Listeria monocytogenes和Salmonella［4］。

沙门菌属(Salmonellaspp. )是与食源性疾病发作有关的最常见的病原菌，最初常见于家禽产品中，现也与鲜切产品相联系。1998 －2002 年，美国爆发的食源性疾病事件中，有13.1%是由沙门菌属引起的［5］，在我国，1994 －2003 年间，766 起细菌性食物中毒事件中沙门氏菌发生132 起，排名第2;中毒人数比例最大，为20.4%(8928 人)，在132 起事件中，以肠炎沙门氏菌所占比例最大，为26.5%［6］。英国的一项调查表明，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染占到人类沙门氏菌感染病例的75%以上［7］。一系列被沙门菌感染的果蔬中，最常见的是生菜、发芽的种子、瓜类(如西瓜和甜瓜)和马铃薯。从原料供应到最终产品，沙门氏菌常从生菜、花椰菜、芽菜、芥菜苗、莴苣、菠菜、蘑菇、豆芽、苜蓿、未经高温杀菌的果汁和新鲜果蔬沙拉中分离出来［8］。

本试验以苹果、卷心菜、生菜为原料，研究了肠炎沙门氏菌在3 种鲜切果蔬中的生长情况，并考察4 种不同温度(4、10、15、30℃)对肠炎沙门氏菌生长的影响，以期对GP 模型的预测准确性进行验证，从而为控制鲜切果蔬中致病菌的生长提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料及菌株

生菜、卷心菜、苹果均购于当地农贸市场，运回实验室后放置于4℃冰箱备用;肠炎沙门氏菌标准菌株CICC21482，四川农业大学食品学院微生物实验室馈赠。

1.1.2 培养基及主要仪器

亚硫酸铋(BS)培养基，蛋白胨;HR40-ⅡA2 生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司;SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;DNP-9126 型恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 样品处理及接种

1.2.1 样品的准备

生菜、卷心菜弃去外层受损叶片，流动自来水冲去叶片上的泥土，用锋利的小刀切成3 cm ×0.5 cm(长×宽)左右的条，苹果去皮后，切成1 cm3左右的小丁，置于50 mg/L 的ClO2溶液中杀菌2 min，无菌蒸馏水漂洗，捞出于无菌超净工作台中自然晾干。无菌操作，称取10g 样品于保鲜袋中，备用。

1.2.2 接种液准备

挑取肠炎沙门氏菌斜面培养物接种于10mL 无菌营养肉汤中，37℃培养14 h 后冷冻离心(5000 ×g，10 min)，弃上清液，加入10 mL 无菌营养肉汤，制成菌悬液，用无菌肉汤适当稀释，获得菌量约103～104CFU/mL 的接种液，接种液中SE 的数量通过涂布平板计数获得。

1.2.3 样品接种

采用点植法［9］，用移液器取0.1 mL 接种液，均匀接种在保鲜袋中的10 g 样品中，大约15 个点左右，置于生物安全柜中自然晾干2h，使接种液中的SE 充分附着在样品上。

1.2.4 处理

将接种好样品的保鲜袋分别置于4、10、15、30℃条件下保藏7 d，定时取样，4、10℃每12 h 取样，15℃前2 d 每12 h 取样，后5 d 每24 h 取样，30℃第1 天每4 h 取样，后6 d 每24 h 取1 次样。

1.2.5 肠炎沙门氏菌的计数

取出保鲜袋后，无菌加入90 mL 无菌BPW 缓冲蛋白胨水，拍打2 min 后，无菌生理盐水梯度稀释，选择合适的梯度稀释液0.1 mL 涂布BS 培养基，待培养基充分吸收菌液后，放至37℃培养箱中培养48 h，然后计算SE 的数量。

1.2.6 应用的模型

应用ComBase 数据库中的生长预测模型GP 预测SE 的生长，DMFit 软件拟合SE 在3 种鲜切果蔬中各温度下生长的观察值，GP 是基于Baranyi 和Roberts 模型的预测模型，Baranyi 和Roberts 模型的表述为:

式中:N为t时微生物数量;N0为0 时微生物数量;Nmin为最小微生物数量;Kmax为最大相对死亡率;r，s为参数［10］。

1.2.7 模型可靠性评价

采用修正决定系数(Adjusted R Square，R2Adj)来评价模型的拟合度，R2Adj越接近1，表示预测模型对实验数据拟合度越高。R2Adj用下式表示:

式中:R2为决定系数;N代表预测模型中变量参数的个数;n为试验次数。

采用均方根误差(Root Mean Square Error，RMSE)、准确因子(Accuracy factor，Af)和偏差因子(Bias factor，Bf)来评价已建立的SE 动力学预测模型的可靠性［11］。RMSE 越小，表示模型预测值的离散程度越小;Af越接近1，模型的准确度越高;Bf小于1表明，其预测的SE 在鲜切果蔬中的生长比实际生长速度慢。RMSE、准确因子和偏差因子用下式表示:

式中，Nobs是试验实际测得的SE 数量;Npre是应用模型预测得到的与Nobs同一时间的SE 数量;n是试验次数。

2 结果与分析

2.1 不同温度下SE 在鲜切苹果中的生长情况

鲜切苹果中SE 的最初接种量在3.4 ～3.7log(CFU/g)之间。如图1 中实际观测值可见，4℃条件下，SE 的生长基本受到抑制，并有下降的趋势;30℃下SE 在48h 内生长迅速，最先生长到最大菌落数6.74log(CFU/g)，依次是15℃、10℃，但后两者均未达到30℃条件下的最大菌落数。同时，30℃在48h后最先减少，稳定期的时间也短于其他两种温度，当细菌数量减少到一定数量时，其在鲜切苹果中的数量基本趋于稳定，约在4.0 ～5.0log(CFU/g)之间。

用DMFit 软件拟合SE 在不同温度下的生长曲线，拟合的曲线由图1 中的实线表示，结果见表1，10、15、30℃温度下的拟合度较好，R2Adj分别是0.97、0.92、0.95，均高于4℃的0.72。从最大生长速率可以看出，4℃下156h 内，SE 在鲜切苹果中最大生长速率为负值，在剩余3 种温度下，最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测SE 在肉汤培养基中的生长状况，预测的生长曲线见图1 中的虚线，SE在肉汤培养基的生长明显不同于在鲜切苹果中的生长，GP 对10、15℃的预测偏低，对30℃的预测则偏高。除4℃外，其在10、15、30℃3 种温度下生长的最大菌落数均不能达到GP 所预测的最大值。

表1 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切苹果中的拟合结果Table 1 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut apple at different temperatures

2.2 不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的生长情况

鲜切卷心菜中SE 的最初接种量在3.1 ～3.7log(CFU/g)之间。如图2 中实际观测值可见，4℃下基本受到抑制;10、15、30℃下SE 分别在72、48、48h 生长到最大菌落数6.61、6.54、6.69log(CFU/g)。10℃在108h 后菌数开始减少，而15、30℃在达到最大菌落数后的数量基本趋于稳定，约在5.8 ～6.0log(CFU/g)之间。

DMFit 软件拟合的曲线由图2 中的实线表示，其结果见表2，4、10、15、30℃下R2Adj分别是0.81、0.98、0.90、0.90，4℃下156h 内，SE 最大生长速率为负值，而在其余3 种温度下，最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测其生长曲线见图2 中的虚线，GP 对10℃的预测偏低，对30℃的预测则偏高。

图1 不同温度下SE 在鲜切苹果中的生长特征与GP 预测曲线Fig.1 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut apple at different temperatures

图2 不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的生长特征与GP 预测曲线Fig.2 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures

表2 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切卷心菜中的拟合结果Table 2 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures

2.3 不同温度下SE 在鲜切生菜中的生长情况

鲜切生菜中SE 最初接种量在3.4 ～3.7log(CFU/g)之间。如图3 中实际观测值可见，4℃下基本受到抑制;10℃、15℃、30℃下SE 分别在48、48、24 h 进入稳定期。10℃达到最大菌落数后的数量基本趋于稳定，15、30℃在进入稳定期后数量就开始减少。

DMFit 软件拟合的曲线由图3 中的实线表示，其结果见表3，4、10、15、30℃下R2Adj分别是0.92、0.99、0.95、0.94，4℃下156h 内，SE 最大生长速率为负值，而在其余3 种温度下，最大生长速率从大到小依次为30、15、10℃。用GP 预测其生长曲线见图3 中的虚线，GP 对10℃的预测偏低，对30℃的预测则偏高。

图3 不同温度下SE 在鲜切生菜中的生长特征与GP 预测曲线Fig.3 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures

表3 DMFit 软件对不同温度下SE 在鲜切生菜中的拟合结果Tab.3 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures

2.4 预测值相对于实测值的Af及Bf

GP 模型的预测值与DMFit 软件拟合的实测值的准确因子(Af)及偏差因子(Bf)见表4。

表4 GP 模型的预测值相对于实测值的Af及BfTab.4 Accuracy and bias factors of GP model compared with observations

3 结论与讨论

肠炎沙门氏菌可以在10、15、30℃的鲜切苹果、卷心菜、生菜中迅速生长，并且可以在4℃下存活，但是SE 在鲜切果蔬中的最大菌落数均不能达到GP 中的预测值，这与GP 模型的建立是基于肉汤液体培养基有关，当以食品为介质时，其预测存在一定的偏差［12］。本研究采用向原料食品中接种特定微生物来获得数据建立模型，这种方法可以考察食品原料组织对特定微生物生长的影响，所建模型能更好预测特定微生物在实际食品中的生长［13］。苹果、生菜切割后于30℃保存后的第2d 就开始腐败，腐败菌的大量生长及营养物质的消耗也会影响沙门氏菌的生长，同时，沙门氏菌对鲜切果蔬中本身存在的微生物如乳酸菌、肠杆菌也有显著的敏感性［14］，使之不能达到理论的最大菌落数，也没有达到4.0log(CFU/g)的增量，这结果与Vandamn［15］在22℃鲜切芹菜及Zhuang［16］在30℃土豆中的研究一致。但也有研究表明，沙门氏菌在25℃的鲜切桃中可生长到8.0log(CFU/g)［17］，其数量却在25℃的苜蓿芽中有所下降，这与苜蓿芽的蜡状角质层有关［18］。

鲜切果蔬的内在因素(如果蔬本身的pH、营养物质组成等)及所处的外部环境均会影响致病菌的生长［19］，因此，SE 在不同的鲜切果蔬中的生长存在一定的差异，但是，影响其生长的最主要因素还是温度及pH。本研究中，4℃可显著抑制SE 在鲜切苹果、卷心菜、生菜上的生长，这与Kakiomenou 等［20］的研究结果一致。在10、15、30℃下SE 的生长曲线相似，但生长速度不同，温度越高，生长速度越快，最大菌落数越大。pH 已与温度一同被认为是新鲜果蔬中影响微生物生长的决定性因素，但是，即便是酸性较高的产品(如苹果)，致病菌也可在其上生长，甚至在10℃或以上温度时以指数方式生长［21］。但也有研究表明沙门氏菌不能在pH 低于4.0 的环境中有规律地生长［22］，如24℃下pH3.6 ～3.8 的鲜切草莓，其原因可能是与果蔬中有机酸的种类有关［23］。

本试验用DMFit 软件对3 种鲜切果蔬中SE 在4种温度下生长状况进行拟合，DMFit 是基于Baranyi和Roberts 模型的拟合软件，Baranyi 和Roberts 模型能够在温度波动条件下获得较为理想的预测效果［24］，本试验中，DMFit 只能拟合SE 在鲜切果蔬中生长的前段时间，拟合结果显示4 种温度下的拟合曲线均没有延滞期。GP 模型对SE 的生长预测温度范围为7 ～40℃，因此，本研究中没有对4℃下的Af及Bf进行讨论，其余温度下三种鲜切果蔬的预测值相对于实测值的Af在1.10 ～1.48 之间，Bf在0.82 ～1.48 之间，而Ross 曾提出，Af小于1.15，Bf介于0.9 ～1.05间可作为一个好的预测模型的判定标准，二者数值接近1，表示预测模型的可靠程度越高［12］。由此可见，本研究中GP 模型预测在一定程度上与实测值存在一定的差异。

本试验研究了肠炎沙门氏菌在不同温度下鲜切果蔬中的存活及生长，为确保鲜切果蔬的安全，可选择4℃的冷藏温度作为鲜切果蔬保存温度，虽然GP模型对SE 的预测有一定的偏差，但在没有更好的预测模型之前，GP 的预测仍具有参考价值，只是在安全风险评估中要考虑预测的误差。同时，在果蔬采后及加工中运用良好农业规范(GAP)、良好操作规范(GMP)及危害分析和关键控制点(HACCP)等方法也是十分必要的。

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