维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8产L-色氨酸的影响

娄秀平， 沈健增， 蔡宇杰*， 廖祥儒， 张大兵

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏 淮安223001）

色氨酸是一种重要的氨基酸，对于人类和动物的生长发育、新陈代谢有着重要的生理作用，参与多种生物物质合成并广泛应用于食品、动物饲料、医药工业[1]。

长久以来，色氨酸都是在氨基酸生产中产业化难度较大的一种氨基酸。色氨酸的生产方法主要有：化学合成法、蛋白水解法、微生物法。微生物法大体上又可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸产生菌来生产色氨酸[2-4]。在色氨酸的生物发酵中，大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌。近几年来，由于在生产中有缩短生产周期、减少设备投资、降低成本、提高生产效率等优点，大肠杆菌高密度发酵生产色氨酸得到国内外的广泛关注。目前大肠杆菌生产色氨酸最大可达到54.6 g/L[5]。

维生素是细胞生长和代谢所必需的物质，在L-色氨酸的合成及降解途径中，很多维生素作为辅因子直接参与调控L-色氨酸的代谢过程。因此，研究维生素对色氨酸生产的影响有着重要的意义。作者选择在全合成培养基中，考察可能与L-色氨酸代谢密切相关的9种维生素对大肠杆菌合成L-色氨酸的影响，通过比较不同维生素对菌体细胞生长、L-色氨酸的积累的影响，确定了这9种维生素的最优用量[6]。

1 材料与方法

1.1 菌种

大肠杆菌Escherichia coli.JN8由作者所在实验室保存。

1.2 培养基

保藏培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠 10，琼脂 20，四环素 0.01；pH 7.0～7.2，于 121 ℃湿热灭菌30 min。

种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠 10，四环素 0.01；pH 7.0 ～7.2，于 121 ℃湿热灭菌30 min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，（NH4）2SO411.5，KH2PO46，MgSO4·7H2O 2，FeSO4·7H2O 0.25；于 115 ℃湿热灭菌20 min。

各种维生素配制成浓缩液，用0.22 μm的无菌滤膜过滤除菌，在-20℃下保存，临用前置于室温使其融化，于接种的同时添加到摇瓶培养基中。添加生物素使其在培养基中终质量浓度分别为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mg/L；叶酸在培养基的终质量浓度分别为 0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0 mg/L；VB2（核黄素）在培养基的终质量浓度为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/L； 肌醇、VB1（硫胺素）、 VB3（烟酸）、VB5（泛酸）、VB6（吡哆醇）、VC（抗坏血酸）在培养基中的终质量浓度均分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/L； 对照则不添加任何维生素。

1.3 方法

1.3.1 种子制备 从甘油管中取菌，在种子培养基斜面或平板划线，33℃培养12～15 h。种子培养基30 mL置于250 mL的三角瓶中，接入新鲜斜面菌种一环，33 ℃、250～300 r/min培养 9 h。

1.3.2 摇瓶培养 种子液以10%体积分数的接种量接入发酵培养基中，摇瓶发酵装液量为30 mL（250 mL的三角瓶），33℃、250 r/min培养 24 h。

1.3.3 菌悬液OD值的测定 发酵液用蒸馏水稀释50倍数，于紫外可见光分光光度计上测600 nm处的吸光光度。

1.3.4 色氨酸总量的测定 发酵液中色氨酸总量按照文献[7]所述方法测定。

2 结果与讨论

2.1 肌醇和叶酸的添加浓度对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

如图1所示，当肌醇质量浓度为0.2 mg/L时菌体浓度和L-色氨酸含量均达到最大值，与对照相比分别提高了16.8%和14%。随着肌醇质量浓度的增加，L-色氨酸含量减少，但是与对照相比菌体浓度仍有所提高。这说明低质量浓度的肌醇促进L-色氨酸合成，而添加不同质量浓度的肌醇均有利于菌体的生长。当叶酸为0.000 2 mg/L时菌体浓度和L-色氨酸含量达到最大值，与对照相比分别提高了16.8%和26.4%。叶酸的活性辅酶形式四氢叶酸（THF）是一碳循环中的辅酶与底物，并随碳循环参与核酸代谢、氨基酸的合成[3-4]，是影响微生物生长代谢的重要物质。但是随着叶酸质量浓度的增加，菌体浓度和色氨酸含量均出现明显的降低趋势，L-色氨酸的含量低于对照，而菌体浓度较对照仍有所提高。这同样说明低质量浓度的叶酸促进色氨酸合成，而添加不同质量浓度的叶酸均有利于菌体的生长。

图1 肌醇和叶酸质量浓度对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.1 Effect of concentration of Inositol and Folic acid on thegrowth ofEscherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.2 生物素的添加浓度对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

如图2所示，当生物素的质量浓度小于0.12 mg/L时，随着生物素的质量浓度升高，菌体浓度及色氨酸的含量均有所升高。当生物素质量浓度为0.12 mg/L时，菌体浓度和色氨酸的产量达到最大，分别比对照提高了24.2%和30.4%。可能是生物素改变了细胞膜的成分及通透性[4，8]，让更多色氨酸分泌到胞外，减少了反馈抑制，从而提高了发酵液中的色氨酸含量。尽管当质量浓度为0.15 mg/L时，色氨酸的产量低于对照水平，但是菌体浓度较对照仍有9.3%的提高。这与吴琳[9]等研究增加生物素浓度，菌体生长得到改善的实验结果相同。所以，适量添加生物素对菌体生长和色氨酸的合成均有明显的促进作用。

图2 生物素质量浓度对Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.2 Effect of the Biotin concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.3 VB6的添加浓度对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

在VB6质量浓度较低时，L-色氨酸的合成受到明显的抑制，而菌体的生长几乎不受影响。如图3所示，当VB6质量浓度为0.8 mg/L时，菌体浓度和色氨酸的产量均较对照有着显著的提高，分别提高11.8%和27.2%。随着添加浓度进一步提高，色氨酸的产量再次受到抑制，而较高质量浓度VB6的添加促进菌体生长。这可能是添加VB6在促进L-色氨酸的合成同时也促进L-色氨酸的分解。VB6在细胞内主要以磷酸酯形式存在，磷酸吡哆醛（PLP）和磷酸吡哆胺是其活性形式，是氨基酸代谢中多种酶的辅酶[4]。其中PLP参加催化涉及氨基酸的各种反应。何俊峰[10]研究指出VB6参与胞内一些转氨、脱氨、转硫反应并参与氨基酸的脱羧基反应。

2.4 VB5的添加浓度对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

如图4所示，随着VB5质量浓度的升高，色氨酸的产量呈先升高后降低趋势，当质量浓度为0.4 mg/L时，色氨酸的产量达到最大值，较对照提高14.3%。当质量浓度为0.8 mg/L时，菌体浓度达到最大，较对照提高10.6%。可能是VB5（泛酸）的主要活性形式辅酶A（CoA）在细胞内主要起传递酰基的作用，是各种酰化反应中的辅酶，参与糖代谢及氨基酸代谢[4，11]。所以，VB5的添加可以明显地促进菌体的生长，并有利于L-色氨酸的合成。

图3 VB6质量浓度对Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.3 Effect of VB6concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

图4 VB5质量浓度对Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.4 Effect of VB5concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.5 VB1和VC对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

VB1（硫胺素）与糖代谢密切相关，VC（抗坏血酸）在胞内氧化还原反应中起递氢体的作用[10-12]，这两种维生素含量的变化可能对L-色氨酸代谢起到微妙的作用。如图5所示，仅当VB1质量浓度为0.4 mg/L时，菌体浓度和L-色氨酸的产量较对照均有所提高。其余质量浓度下色氨酸的合成均受到明显抑制，VB1对菌体的生长作用不明显。VC质量浓度为0.2 mg/L时，L-色氨酸的产量为最大值，而在VC的各个添加浓度下，菌体浓度均明显高于对照水平。这说明VC的添加有利于菌体生长但却抑制色氨酸合成。

图5 VB1及VC对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.5 Effect of VB1and VC on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.6 VB2和VB3对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响

VB2（核黄素）是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的物质。VB3（烟酸）在胞内转变为烟酰胺，后者是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与胞内的生物氧化过程[11]。这两种维生素的添加可能对氨基酸的合成有一定的影响。如图6所示，当VB2和VB3质量浓度均为0.4 mg/L时，L-色氨酸的产量达到最大，但是都略微低于对照水平。随着添加浓度的增加，两种维生素均抑制L-色氨酸的合成。当VB2和 VB3质量浓度分别为 0.6 mg/L和0.8mg/L时，菌体浓度最大。但是VB2在各个添加浓度下，菌体浓度均明显高于对照水平。这说明VB2和VB3的添加抑制大肠杆菌色氨酸的合成。

图6 VB2和VB3对大肠杆菌 Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响Fig.6 Effect of VB2and VB3on the growth of Escherichia coli.JN8and L-tryptophan production

3 结语

采用单因素法研究了肌醇、叶酸、生物素、VB1、VB2、VB3、VB5、VB6和 VC 对 大 肠 杆 菌 Escherichia coli.JN8生长和L-色氨酸产量的影响。研究结果显示，低质量浓度的肌醇（0.2 mg/L）和叶酸（0.000 2 mg/L）可显著促进菌体生长及L-色氨酸的合成，随着两种维生素质量浓度的增加L-色氨酸的合成受到不同程度的抑制作用，而菌体的浓度虽然呈下降趋势但菌体的生长仍然受到促进作用；添加较高质量浓度（0.09～0.12 mg/L）的生物素可以明显促进菌体生长及L-色氨酸的合成；仅在质量浓度为0.8 mg/L时，VB6对菌体生长及L-色氨酸的合成有显著的促进作用，其余质量浓度下L-色氨酸的合成均受到严重的抑制作用；尽管不同质量浓度的 VB1、VB2、VB3和VC的添加对菌体的生长均有较强的促进作用，但对于L-色氨酸合成却有不同程度的抑制作用。可能这些维生素作为辅因子不仅参与了L-色氨酸的合成过程，还参与了L-色氨酸的降解过程。同样不同质量浓度的VB5对菌体的生长有明显促进作用，而仅在0.4～0.8 mg/L质量浓度下对色氨酸的合成有较微弱的促进作用。

近年来，随着对L-色氨酸研究的不断深入，L-色氨酸不仅得到广泛的应用并且对其需求越来越大，目前的产量远不足以满足需求。所以如何提高L-色氨酸的产量将成为后续研究的重点。

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