五株虫生真菌对白纹伊蚊成蚊及幼蚊致病力的研究*

卢健聪 曾润深 曾 科 魏姗姗 李雪兰 陆 洋 彭鸿娟

(南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系，广东 510515)

蚊虫是疟疾、丝虫病、日本流行性乙型脑炎、登革热等疾病的重要传播媒介。据世界卫生组织统计，全球约25亿人有登革热感染的危险，每年有1亿新感染病例，其中50万重症患者需住院治疗(张复春，2011)，极度影响人类健康、社会的稳定、经济的发展。白纹伊蚊Aedesalbopictus位于我国媒介昆虫和传播登革热的蚊种之首。在蚊媒防治中，过去几十年我国主要应用化学杀虫剂进行防治，在预防疾病流行方面起着举足轻重的作用(邵柏等，2002)，但长期使用化学杀虫剂造成的严重环境污染，可通过生物链传递进而危害人体健康，同时蚊虫抗药性的产生带来的弊端也日益显现，因而寻求新的有效的防治方法成为医学界面临的重要课题。

蚊虫的生物防治主要应用蚊虫病原体、寄生物、捕食物来达到防治效果，同时具有对非目标生物和有益生物无害的特性，不污染环境以及不易产生抗性等优点(Thomasetal.，2007)。球孢白僵菌Beauveriabassiana作为一类重要的天敌生物资源，因其易于生产、寄主范围广的特点，能浸染15目149科的700多种昆虫，具有侵染期长、不伤害人和其他脊椎动物的优点，倍受人们的关注(Blakeetal.，2002；Tafoyaetal.，2004)。从20世纪50年代开始，球孢白僵菌已被应用于防治玉米螟、大豆食心虫和甘薯叶甲，而中国是世界上生产和使用白僵菌最多的国家，利用球孢白僵菌防治松毛虫的经验与技术令全世界瞩目(杨怀文，2005)。

Mnyone等(2010a,b)系统地研究了球孢白僵菌及绿僵菌孢子粉施用方法，以及蚊龄、吸血情况等生理因素对驱蚊的易感性的影响。研究证明，在对蚊虫施用球孢白僵菌及绿僵菌后28 d内均能够降低蚊虫的成活率，分生孢子施用于泥板及棉布上比施用于聚脂纤维网上的效果好(Mnyoneetal., 2010a)；这两种真菌的矿物油制剂对所测试的蚊虫有驱避作用，可用作真菌杀虫剂(Mnyoneetal., 2010b)。这两种真菌对蚊虫的各龄段具有感染性和致病性，但对未吸血蚊虫具有更好的敏感性(Mnyoneetal., 2010c)。

本研究以国内外生物防治中常用的几株虫生真菌为材料，分别研究其对白纹伊蚊幼虫和成蚊的致病力，以期筛选出高致病力菌株，并进一步探寻影响该菌株发挥高致病毒力的相关条件，为蚊虫的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验菌种及培养: 球孢白僵菌B.bassianaGIM3.428、GIM3.45、GIM3.46、GIM3.436及金龟子绿僵菌MetarhiziumanisopliaeGIM3.528株，均购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买，按使用说明配制成斜面固体培养基。将以上菌株接种于PDA斜面培养基上，25℃生长5～6 d，在培养基上长满孢子后在4℃保存。

1.1.2蚊虫饲养: 白纹伊蚊为南方医科大学病原生物学系传代培育品系，幼虫喂食生酵母片，成蚊饲喂10%的葡萄糖水，喂SPF级昆明鼠血产卵传代。幼虫与成蚊都饲养于温度为30℃、相对湿度70%～80%，光周期为光照∶黑暗=12L∶12D 的自动温湿控制的蚊虫培养室内。

1.2 毒力测试实验

1.2.1白僵菌孢子和绿僵菌孢子的准备：用无菌棉签从长满孢子的PDA斜面上刷下孢子至无菌水中，用血球计数板计数后，用无菌水稀释成3.0×108个/mL的孢子悬浮液，用于对蚊幼虫的毒力测试实验；或者将生长于固体培养基上的孢子粉直接用于对成蚊的毒力测试试验。

1.2.2对幼虫的毒力测试: 以一次性透明塑料杯作为容器，将孢子悬浮液用无菌单蒸水稀释到1.0×102、1.0×103、1.0×104(单位：个/mL)等3个测试浓度各30 mL，以30 mL无菌水作为浓度为“0”的空白对照。每个浓度设3个重复组，每组选用20条健康、大小相同的白纹伊蚊二龄幼虫进行试验，于蚊虫培养室内进行。试验进行12 h后，给每杯幼虫喂食生酵母粉1 g/杯，之后每天喂饲1次(1g/杯)，逐日统计累计死亡幼虫数，扣除空白对照组的正常死亡数后计算校正死亡率(羽化蚊虫记为存活个体)，连续观察10 d。

1.2.3对成蚊的毒力测定: 将长满白僵菌或绿僵菌孢子粉的PDA斜面用无菌竹签完整刮下，放置在一次性透明塑料碗中，然后置于蚊笼中，并以未接种的PDA斜面作为空白对照，每个菌株及空白照均设3个重复组。在每笼中放入30只健壮、羽化时间一致的白纹伊蚊成蚊，雌雄比例为1∶1，试验于蚊虫培养室内进行。试验进行12 h后，用10%葡萄糖溶液喂养。逐日统计累计死亡成蚊数和死亡率，连续观察10 d。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对所有试验数据进行统计处理，以每实验组中3个重复组的累计死亡率的平均值作为该实验组的累计死亡率，用配对样本t检验对每两个不同菌株在同一天的累计死亡率进行差异显著性的检验(P<0.05为显著性差异)。用Excel软件作图。

2 结果

2.1 幼虫实验

将4株白僵菌(GIM3.428、GIM3.45、GIM3.46、GIM3.436)和1株绿僵菌和GIM3.528的孢子悬液配制为浓度为1×102、1×103、1×104个孢子/mL，分别处理白纹伊蚊幼虫10 d后，观察累计校正死亡率。从图1可见，各菌株对白纹伊蚊幼虫10 d累计校正死亡率，随孢子浓度的增加而平稳的增大；同时从各菌株累计校正死亡率的趋势图可见, GIM3.428、GIM3.45、GIM3.528、GIM3.436、GIM3.46各菌株对白蚊伊蚊幼虫的毒力依次降低。GIM3.428株在1×104个孢子/mL浓度下对蚊幼虫的致死率达(46.7±2.3)%，已接近半数致死浓度。

图1 白纹伊蚊幼虫在五株不同浓度的虫生真菌孢子悬液中的10日累计校正死亡率Fig.1 The ten-day adjusted cumulative mortality of Aedes albopictus larvae in five strains of entomogenous fungi spores’ suspension in different concentration

图3 白纹伊蚊成蚊感染五株白僵菌孢子后的逐日累计死亡率Fig.3 The cumulative mortality per day of Ae. albopictus adults affected with five strains of entomogenous fungi spores

图2 白纹伊蚊幼虫在五株白僵菌孢子悬液(浓度1×104个/mL)中的逐日累计死亡率Fig.2 The cumulative mortality per day of Ae. albopictus larvae in five strains of B. bassiana spores’ suspension (1×104 spores/mL concentration)

故而，我们选用浓度为1×104个/mL的5株菌株孢子悬液处理白纹伊蚊幼虫10 d，每天的累计死亡率见图2。5株菌株对白纹伊蚊幼虫的累计死亡率均随实验时间延长而平稳地增加。实验第10 d，GIM3.428、GIM3.45、GIM3.528、GIM3.436和GIM3.46对白纹伊蚊幼虫的累计死亡率分别为(46.7±2.3)%、(45.0±4.0)%、(41.7±2.3)%、(35.0±4.0)%和(25.0±4.0)%，且观察期内不存在累计死亡率大幅度变化的区间。菌株GIM3.428和GIM3.45对白纹伊蚊幼虫的致死率最高，且两者的逐日累计死亡率差异无统计学意义(P=0.964)；菌株GIM3.46的致死率最低，10 d累计校正死亡率仅为(25±4.0)%；各组中的逐日幼虫累计死亡率与空白组的差异有统计学意义(P=0.004)。经过这5株菌株处理后，幼虫的死亡率明显高于空白组。

2.2 成蚊实验

5株菌株孢子感染白纹伊蚊成蚊后，其累计死亡率见图3。由图可见，等量白僵菌感染白纹伊蚊成蚊的过程中，成蚊的累计死亡率均随实验时间延长而稳步增加。GIM3.45、GIM3.428、GIM3.528、GMIM3.436和GIM3.46对白纹伊蚊成蚊的累计死亡率分别为(51.1±4.1)%、(37.8±3.1)%、(38.9±4.1)、(30.0±2.7)及(17.8±3.1)。其中GIM3.45处理成蚊的累计死亡率最高，且第6 d死亡率明显增加。5株菌株逐日的累计死亡率与空白组之间的差异有统计学意义(P=0.000)。

3 讨论

从实验结果可见，白纹伊蚊幼虫的累计校正死亡率随着野生型白僵菌孢子悬液浓度的提高而增加。这可能是因为随着孢子浓度的提高，幼虫感染孢子的机会增加，随之发病率也上升。此外，实验结果还显示不同菌株对白纹伊蚊的致病力存在一定的差异。菌株GIM3.428和GIM3.45对白纹伊蚊幼虫的致病力最强，10 d累计死亡率分别为(46.7±2.3)%、(45±4.0)%，且两菌株毒力无显著性差异；菌株GIM3.46对幼虫的致病力最弱，其10 d累计死亡率仅为25%，但累计死亡率与空白组之间具有显著性差异。在成蚊实验中，菌株GIM3.45，GIM3.428，和GIM3.528对成蚊的致病力最强，其10 d累计死亡率分别为(51.1±4.1)%、(37.8±3.1)%和(38.9±4.1)。综合对于成蚊以及幼虫的实验结果分析，菌株GIM3.428和GIM3.45对白纹伊蚊成蚊及幼虫均具有最强的毒力。

目前关于真菌对蚊的致病力的研究，国内学者也进行过多个试验。刘丽娟等(2011)利用5株虫生真菌防治淡色库蚊防治蚊幼虫，结果发现5株虫生真菌中白僵菌菌株GIM3.428对淡色库蚊幼虫的致病力最高。选用大链壶菌对蚊幼虫进行试验，认为大链壶菌通过直接入侵和破坏蚊幼虫组织，进而引起蚊幼虫死亡(包怀恩等,1996)。球孢白僵菌在淡色库蚊幼虫间存在水平传递作用，即感染病原菌的虫体可以作为传染源，进一步释放孢子，增加环境中的真菌含量，使周围正常蚊幼虫感染真菌，在淡色库蚊幼虫中形成病害流行(韦玮和公茂庆，2010)。与此相似，是否在白纹伊蚊感染中也会出现此规律，尚需进一步对比试验方能得出结论。

本试验结果为白纹伊蚊的生物防治，提供了有益的资料。然而在白僵菌灭蚊方面仍有以下问题亟待解决：(1)提高球孢白僵菌的杀灭能力。本试验通过研究5株最常用的虫生真菌对白纹伊蚊幼虫和成蚊的致病性研究，得出GIM3.428和GIM3.45菌株对白纹伊蚊幼虫和成蚊的毒力效果相对理想，且和幼虫的致死效果在10 d时间内大多低于50%，若要其在未来蚊的生物防治中发挥作用，必须进一步提高其杀灭毒性；(2)使用条件的优化。目前国内外毒力实验的研究都建立在将孢子粉混悬于无菌水中，在液态条件下不利于球孢子粉的存活，限制了其使用范围和降低了使用价值；(3)降低其对人体的毒副作用。如已在实验小鼠上发现的弱致病作用(田泽敏等, 2006)和实验大鼠上发现的间质性肺炎、肉芽肿、纤维化等倾向(张冰等, 1996)，应进一步完善实验动物研究，必要时在充分论证的情况下进行规范的临床研究，减少生物灭蚊真菌对人体的伤害。