茭白黑粉菌耐热突变体的辐射诱变选育与生长特征研究

石敏 ，黄建中 ，蒋琴素 ，郭得平 ，张敬泽 ，陈子元

（1.浙江大学原子核农业科学研究所，杭州，310029；2.浙江大学生命科学学院；3.浙江大学农业与生物技术学院）

茭白黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn.）侵染茭白茎顶端组织并在其中大量繁殖后诱导形成茭白的食用器官肉质茎[1～4]。研究表明，茭白黑粉菌的适宜生长温度为15～30℃，32℃时生长受到严重抑制，在液体培养条件下几乎不生长[5，6]。天然茭白黑粉菌对较高温的敏感性通常被认为是平原茭白在夏季高温时期（7～8月）不能孕茭的主要原因[7～8]。7～8月正值蔬菜秋淡季节，因此，选育高温型茭白新品种在生产上具有重要的应用价值。本试验通过对茭白黑粉菌进行辐照诱变，筛选出耐高温的突变体，并对其生长特征作初步分析。

1 材料与方法

1.1 菌株及其培养

从正常膨大茭白（浙茭2号）肉质茎单孢分离茭白黑粉菌菌株（M-T菌株[1]），灰茭黑粉菌菌株（T菌株）直接由其冬孢子萌发，采用土豆-葡萄糖-琼脂（PDA）固体培养基在生长箱中28℃培养。固体培养用于黑粉菌的辐照、耐热筛选和短期保存，耐热菌株保存于40℃生长箱中。

1.2 辐照

茭白黑粉菌菌落在PDA培养基上直径达到20～25 mm时对其进行5，10 kGy两个剂量水平的60Co-γ 射线辐照[9]。

1.3 耐热突变体的筛选

取辐照后的菌落以划线涂布法转接到PDA培养基上，在恒温培养箱中40℃下培养，筛选出耐热突变体株系（H-T菌株）。

1.4 生长测量

生长特征试验采用液体培养法，将菌株接种到100 mL土豆-蔗糖培养液（PSB，土豆 200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）中，含菌培养液起始OD600nm约为0.05，在不同温度下，130 r/min条件下摇瓶（250 mL）培养，稳定期OD600nm可达2.5。

1.5 数据处理

所测指标在不同样品间至少重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 耐热突变体筛选

来自灰茭的T菌株辐照处理后40℃培养过程中全部死亡，未获得耐热突变体。而来自正常膨大茭白的M-T菌株经辐照后，于40℃下培养，在菌落表面形成一些小的突起，这些新生小菌落经过不断划线涂布转接到PDA培养基上培养，5 kGy和10 kGy辐照诱变后各获得10个耐热菌株（H-T菌株），其生长特征如表1所示，培养至对数生长期中期的时间长短可以反映出菌株生长速率的快慢（图1）。耐热突变体中，5K7和5K8菌株分别是生长速率最快和最慢的耐热菌株，培养至对数生长期中期的时间分别需要17 h和28.2 h（表1）。来自正常膨大茭白的M-T菌株、灰茭冬孢子萌发形成的T菌株以及部分5 kGy辐照诱变获得的耐热突变体在土豆-蔗糖培养液（PSB）中的生长曲线如图1所示，可见，H-T菌株生长速率要比M-T和T菌株快。

2.2 温度对茭白黑粉菌生长的影响

在液体培养条件下，茭白黑粉菌M-T和T菌株的适宜生长温度范围为15～28℃，最适生长温度28℃，32℃下几乎不再生长（表2）。在15～40℃范围内，随温度升高，耐热黑粉菌的生长速率加快；温度下降，则菌株生长的延滞期延长。3种菌株延滞期显著延长的临界温度并不相同，以培养至对数期中期的时间作比较，延长为28℃时1.8倍以上的温度分别为 15℃（M-T 菌株）、20℃（T 菌株）和 20℃（HT菌株）。耐热突变体在28～40℃范围内，培养至对数期中期的时间变幅仅20%（表2）。

表1 茭白耐热突变体培养至对数期中期所需时间

图1 茭白黑粉菌M-T菌株、T菌株及部分耐热突变体的生长变化（28℃，130 r/min）

在20～28℃温度范围内，液体培养的T菌株到达对数期中期需要36～66 h，M-T菌株需要59～80 h，H-T菌株仅需要17～51 h（表2）。28℃下培养72 h后这3种菌株的生长均已进入稳定期，40℃下只有耐热突变体进入稳定期生长，而M-T和T菌株培养液的OD600nm与接种起始值相近（图2），表明不再生长。

3 小结与讨论

根据来源、形态和生长特征的不同可以将天然茭白黑粉菌分成2种截然不同的菌株：来自正常膨大肉质茎的“菌丝-冬孢子”型（mycelia-teliospore，M-T）和来自灰茭的“冬孢子”型（teliospore，T）[1～10]。T菌株在肉质茎膨大初始阶段就开始形成冬孢子堆，潜育期较短[11]。本研究结果表明，T菌株和M-T菌株均不能在32℃以上繁殖，这与前人报道[5，6]一致。在20～28℃范围内，土豆培养基中T菌株的繁殖速率显著快于M-T菌株，而耐热突变体（H-T菌株）的繁殖速率比T菌株更快。从3种菌株延滞期显著延长的临界温度高低分析，H-T菌株和T菌株较高，而M-T菌株较低。因此，H-T菌株在生长特征上与M-T菌株存在较大差异，茭白黑粉菌耐热突变体可否用于选育高温型茭白品种尚不明确。

表2 温度对茭白黑粉菌3种菌株生长的影响

图2 热处理（40℃，72 h）对菰黑粉菌3种菌株生长的影响

尽管T-菌株与M-T菌株类似，对电离辐射也具有极高的抗性[9]，但无论是否经过辐照，均未能从T菌株中分离到耐热菌株，而可以从M-T菌株中分离获得耐热突变体。T-菌株与M-T菌株在抗电离辐射和耐高温方面所表现出的异同性，其分子机理值得进一步探索。

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