河南省2010年结核病流行病学抽样调查点细菌学检测结果分析

李辉 马晓光 石洁 闫国蕊 杨洪毅 赵玉玲

结核病是危害严重的一种传染性疾病，据WHO估计全球约30%的人群感染Mtb，每年新发结核病患者880万［1］。中国作为22个结核病高负担国家之一，总患者数仅次于印度，位居第二。河南省为我国人口第一大省，也是结核病高负担地区，据2000年结核病流行病学抽样调查估算，全省有活动性肺结核患者约46万，其中Mtb阳性肺结核患者约15万［2］。随着国家结核病防治规划和DOTS策略的实施，为揭示河南省结核病现状及变化规律，2010年河南省进行了全省结核病流行病学抽样调查（简称“流调”）。现将调查点的细菌学检测结果分析如下，以期揭示河南省人群中耐药结核病及结核分枝杆菌的基本特性。

材料和方法

一、资料来源

1．调查范围：依据文献［3］的抽样规则，由全国第五次结核病流调技术指导组计算并确定抽取河南省36个点，共涉及18个地市的36个县。对流调点所有的受检对象（包括已知肺结核患者）均进行X线胸片检查；对发现的所有肺结核可疑症状者和（或）胸部X线影像呈肺结核病变或疑似结核病变者，或已知活动性肺结核患者但X线影像未见异常者均作为痰涂片和分离培养检查的对象。按照卫生部的统一部署和河南省卫生厅的组织安排，河南省以地市为单位成立了18个流调队，于2010年4—7月以流调队现场实施，省技术组督导、验收的方式进行了第五次全国结核病流调的河南省现场调查工作。

2．调查对象基本情况：河南省抽样人口99 977名，应检51 135名，实检49 091名，总受检率占抽样人口的49．10%，占应检人口的96．00%；36个流调点所有受检对象（包括已知肺结核患者）均摄X线胸片检查，共发现肺结核可疑症状者和（或）X线胸片异常者2877例。其中活动性肺结核患者261例；年龄15～91岁，平均（51．2±15．95）岁；男189例，女72例。对所有发现的肺结核可疑症状者和（或）X线胸片异常者2877例进行了痰涂片检查，痰涂片阳性35例，痰涂片阳性率1．22%；除2例因痰标本损坏无法痰培养外，2875例均进行了痰分离培养，培养54例阳性。

二、方法

1．痰标本收集和保存：按照文献［3］要求收集和保存痰标本，每位检查对象分别收集即时痰、晨痰和夜间痰各1份，痰标本必须在24h内完成涂片，进行分离培养的痰标本，如当天不能进行分离培养，需4℃冷藏保存，在6d内完成培养工作。

2．涂片检查：对收集的每份痰标本按文献［4］规定的操作程序进行萋-尼染色、显微镜检查和结果判读。痰涂片检查在各流调点进行。

3．痰培养：2877例涂片镜检对象中除2例标本损失外，2875例的痰标本进行了培养，每例患者从涂片镜检后的3份痰标本中选择2份涂片高阳性级别或1份涂片阳性和1份涂片阴性但质量好的标本，或2份质量好的涂片阴性标本按照文献［5］的方法进行碱处理简单法消化，消化液分别接种于2管改良酸性罗氏培养基上（珠海贝索生物技术有限公司），37℃培养。分枝杆菌分离培养在各流调点进行，阳性培养物送河南省结核病参比实验室进行菌型鉴定、药敏试验及菌株分型。

4．菌型鉴定：河南省结核病参比实验室刮取培养管内的培养物，按文献［4］规定的操作程序进行萋-尼染色和显微镜检查，鉴别是否为抗酸杆菌。

对鉴别为抗酸杆菌的菌株按照文献［3］的方法进行对硝基苯甲酸（PNB，500μl／ml）Mtb菌型鉴定。

5．菌株测序：对鉴别为非抗酸杆菌和非结核分枝杆菌的菌株进行16srRNA基因测序［6］，以鉴别菌株的种属。扩增引物序列为F：5′-CATGCAAG TCGAACGGAAAGG-3′，R：5′-CGAACAACGACAAACCA-3′。PCR反应体系20μl，包括2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技（北京）有限公司］5μl，模板1μl，20μmol引物F、R各0．5μl，13μl去离子水。PCR反应条件：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共40个循环；最后72℃延伸10min；产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，目标片段500bp。扩增产物送上海英俊生物技术公司测序。

6．药敏试验：对鉴别为结核分枝杆菌的菌株按照《全国第五次结核病流行病学抽样调查实施细则》进行利福平（RFP）（40μl／ml）、异烟肼（INH）（0．2 μl／ml）、乙胺丁醇（EMB）（2μl／ml）和链霉素（S）（4μl／ml）、对氨基水杨酸（PAS）（1μl／ml）、卡那霉素（Km）（30μl／ml），氧氟沙星（Ofx）（3μl／ml）药敏试验，同时按照WHO推荐的抗结核二线药物药敏试验［7］进行丁胺卡那霉素（Am）（30μl／ml），卷曲霉素（Cm）（40μl／ml）的检测。

7．北京基因型的鉴定：根据多重PCR（DTMPCR）方法鉴定菌株北京基因型，具体参照参考文献［8］进行操作，引物 P1：5′-GGAGTCGTTGAGGG TGTTCATCAGCTCAGTC-3′，P2：5′-CGCCAAG GCCGCATAGTCACGGTCG-3′，P3：5′-GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT-3′。反 应 体系为10μl，包括：0．2μmol引物P1、P2、P3（大连宝生物工程有限公司）各加1μl，2×Taq PCR Master-Mix［天根生化科技（北京）有限公司］5μl，模板1μl，去离子水1μl；PCR反应条件为：预变性94℃5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，共25个循环；最后72℃延伸7min。菌株扩增得到761bp片段，即为北京基因型，若扩增得到1466bp片段，即属于非北京基因型。

三、质量控制

各流调点的实验人员按照《全国第五次结核病流行病学抽样调查实施细则》的要求进行了技术培训，河南省结核病参比实验室对流调点实验室按照文献［4-5］的要求和程序开展了痰涂片镜检和Mtb分离培养的质量控制。各流调点痰涂片镜检未出现假阳性和假阴性结果，Mtb分离培养的污染率小于5%和涂阳培阴率小于10%，均符合《全国第五次结核病流行病学抽样调查实施细则》的实验室质量要求。河南省结核病参比实验室药敏试验接受WHO跨国结核病参比实验室质量控制［9］，药敏试验质量符合WHO质量控制要求。

四、统计学分析

按照患者初复治、年龄、性别等流行病学基础资料，以及涂片、培养、鉴定、药敏试验结果等，使用SPSS 11．5统计软件建立数据库并进行统计学分析，分析耐药率差异使用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、痰涂片和菌种鉴定结果

2877例可疑肺结核患者中发现痰涂片阳性者35例，涂片阳性率1．22%。河南省结核病参比实验室对接收的54例培养阳性菌株进行了传代，其中有1例传代未成功。传代成功的53例菌株经涂片萋-尼染色镜检，其中发现4株为非抗酸杆菌，这4例均为初次涂片阴性而培养阳性，经测序4株非抗酸杆菌均属草酸杆菌科。49例抗酸阳性菌株，经PNB试验45株（91．84%，45／49）为 Mtb；4株（8．16%，4／49）为非结核分枝杆菌，经测序鉴定，1株为鸟分枝杆菌，1株为胞内分枝杆菌，2株为偶发分枝杆菌。

二、药敏试验结果

1．耐药情况：经PNB试验，Mtb阳性的45株菌来源于45例肺结核患者中，39例为初治患者，6例为复治患者；35例为男性，10例为女性；年龄15～87岁，平均（62±19．85）岁。对获得的 Mtb菌株进行了药敏试验，13例肺结核患者对1种或1种以上药物耐药，其中初治患者12例耐药，复治患者仅1例耐药。45例肺结核患者中，男性患者中初治29例，复治6例；女性患者均为初治，经检验男女患者任一耐药率差异无统计学意义（χ2＝0．008，P＝0．930）（表1）。

45例肺结核患者临床分离株对1、2、3、4种和5种抗结核药物的耐药率分别为13．33%（6／45）、2．22% （1／45）、6．67% （3／45）、2．22% （1／45）和2．22%（1／45）。

45例肺结核患者同时对INH和RFP耐药者有3例（均为初治患者），耐多药（MDR）率为6．67%；复治患者6例中仅有1例对INH耐药；45株菌株对Am、Km和Ofx均敏感，对其他6种抗结核药物的耐药率顺位由高到低依次为：S（20．00%）、INH（17．78%）、RFP（8．89%）、PAS（6．67%）、EMB（4．44%）和Cm（2．22%），见表2。

表1 男性和女性患者中不同类型患者的总耐药率

表2 各种抗结核药物在不同类型肺结核患者中的单耐药情况

2．基因型鉴定结果：45株结核分枝杆菌经DTMPCR鉴定为北京基因型的有41株（91．11%），非北京基因型有4株（8．89%）。北京基因型菌株中有35例来自初治肺结核患者，复治患者6例；非北京基因型菌株均来自初治患者。获得北京基因型菌株的肺结核患者总耐药率为29．27%（12／41），MDR率为7．32%（3／41）；非北京基因型菌株患者仅1例耐药，为单耐S，总耐药率25．00%。经检验北京基因型与非北京基因型肺结核患者的总耐药率差异无统计学意义（χ2＝0．032，P＝0．857）。

讨 论

河南省为全国人口第一大省，结核病患者数位于全国前列，自1993年河南省在全国率先开展了“卫生部加强与促进结核病控制项目”；1998年自筹资金开展“河南省结核病控制项目”，2001年河南省人民政府办公厅颁布实施了《河南省结核病防治规划（2001—2010年）》，至2005年全省126个市县，新涂阳患者发现率达到70%，涂阳患者治愈率均达到85%，DOTS覆盖率达100%，成功实现了DOTS策略［10］。本次调查距2000年全省结核病流调相隔10年，按照全国第五次流调方案由国家统一计算和抽样，共抽取了18个地市的36个县的调查点。36个点中有肺结核可疑症状者或（和）X线胸片异常者2877例进行了痰涂片检查，涂片阳性率为1．22%；痰标本分离培养后，Mtb阳性率为1．57%（45／2875）。而2000年河南省的流调显示，共有1887例肺结核可疑症状者和（或）X线胸片异常者进行了痰涂片检查和分离培养，涂片阳性率4．82%（91／1887），分离培养 获 得 Mtb 阳 性 率 为 5．83% （110／1887）［2］。2010年与2000年比较肺结核可疑症状者和（或）X线胸片异常者中涂阳和菌阳率均有了较大的降低，涂阳率和菌阳率是体现人群中肺结核患者传播性的重要指标，涂阳率和菌阳率的降低显示了河南省肺结核病流行特征的变化，也体现了河南省结核病防治工作取得了较好的效果。

耐药结核病、Mtb和HIV双重感染、流动人口已经成为全球结核病防治的三大难题，河南省曾经参与了两轮WHO组织的全球结核病耐药监测。监测数据显示，1996年、2001年河南省总耐药率分别为51．4%、35．3%［11］；同时1985年、1990年和2000年全国结核病流调数据［12］显示，河南省的总耐药率分别为47．2%（50／106）、52．2%（36／69）和29．2%（21／72），为全球耐药结核病高负担地区。但本次调查显示，河南省总耐药率28．89%，低于全球耐药监测和历次流调河南省的总耐药率，也低于全国2007年结核病耐药基线调查［13］显示的全国平均总耐药率（37．79%）。本次调查的MDR率为6．67%，低于WHO耐药监测河南省1996年、2006年的MDR率（22．3%、12．9%），也低于全国结核病耐药基线调查涂阳肺结核患者的MDR率（8．32%）。同时河南省近年开展的连续耐药监测也显示，河南省耐药率水平较全国水平为低［10］，并进入平稳持续状态，显示这些年河南省结核病防控工作取得了一定的成果。但因河南省结核病总患者数位居全国前列，耐药患者数仍然众多，仍是耐药结核病高负担地区。

在河南省历次流行病学调查（1985、1990、2000、2010年）均显示Mtb耐药顺位中，抗结核药物S和INH居于前位，特别是在初始耐药患者中，近期连续耐药监测也显示同样结果［10］，提示河南省的临床医生在治疗结核病患者时应特别注意对这两种药物的控制使用。

本次调查结果显示，Mtb中的北京基因型占主要地位，而北京基因型菌株与非北京型菌株未显示与耐药有高的相关性，同笔者其他研究相一致［8，14］。

由于本次调查中Mtb分离培养主要在调查现场进行，4株培养物经鉴别为草酸杆菌，揭示了我省目前部分基层结核病实验室开展分离培养的能力还需进一步提高。虽然调查点的实验人员在调查前进行了技能培训，但在实际调查工作中，部分实验室因设备设施不足，实验人员又不能很好地控制实验条件，不能满足Mtb分离培养对实验室设施设备和技术条件的要求，出现了杂菌生长而不能正确区分与鉴别的情况。这些均提示，在今后基层实验室的能力建设中，除需对基层实验室工作人员技术能力加强培训外，还需要逐步改善基层实验室的设施设备，建立规范的Mtb分离培养实验室。

［1］World Health Organization． Global tuberculosis control：WHO report 2011．WHO／HTM／TB／2011．16．Geneva：World Health Organization，2011．

［2］焦晓磊，刘传玉，王林，等．河南省肺结核流行趋势及病例发现方法分析．中华结核和呼吸杂志，2002，25（1）：15-17．

［3］王宇．全国第五次结核病流行病学抽样调查资料汇编．北京：军事医学科学出版社，2011．

［4］刘剑君．中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册．北京：中国协和医科大学出版社，2004．

［5］中国疾病预防控制中心．结核菌培养标准化操作及质量保证手册．北京：人民卫生出版社，2009．

［6］Sajduda P，Martin A，Portaels F．Hsp65PCR-restriction analysis（PRA）with capillary electrophoresis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium species．J MicrobiolMethods，2010，80（2）：190-194．

［7］World Health Organization．Policy guidance on drug-suscepti-bility testing（DST）of second-line antituberculosis drugs．Geneva：World Health Organization，2008．

［8］杨洪毅，李辉，马士文，等．MIRU-VNTR技术对源于河南的北京基因型结核分枝杆菌分型研究．中国卫生检验杂志，2010，20（6）：1035-1037．

［9］李辉，闫国蕊，赵玉玲，等．河南省结核杆菌药物敏感性试验质量控制结果分析．河南预防医学杂志，2008，19（6）：410-411．

［10］李辉，靳鸿建，马晓光，等．新密市DOTS执行下耐多药结核病监测分析．中国防痨杂志，2012，34（1）：10-14．

［11］杜长梅，王国斌，徐吉英，等．河南省第二轮结核病耐药监测及耐药趋势研究．中国防痨杂志，2006，28（2）：95-100．

［12］祖燕，赵富山，闫国蕊．河南省历次结核病流行病学调查分枝杆菌药敏试验结果分析．中原医刊，2005，32（16）：45-46．

［13］中华人民共和国卫生部．全国结核病耐药基线调查报告（2007—2008年）．北京：人民卫生出版社，2010．

［14］Li H，Yang HY，Ma XG，et al．Molecular epidemiological features of Mycobacterium tuberculosis in an endemic region of Henan Province，China．Int J Tuberc Lung Dis，2012，16（8）：1097-1099．