Phadia250全自动荧光免疫分析系统性能验证

冯霞 刘子杰 何成禄 徐从琼 李娅 何增品 谢琼

Phadia250全自动体外检测系统是由瑞典Phadia公司研制，基于荧光酶联免疫分析法原理，以提供过敏、气喘及自体免疫疾病的临床诊断和监控为目的，集反应、检测和数据分析为一体的全自动荧光免疫分析系统。ImmunoCAP特异性IgE定量是检测人血清或血浆中过敏原特异性IgE的体外实验方法，是用羊抗人IgE抗体包被的ImmunoCAP，捕获血清中存在的人体受食物和空气中变应原攻击后所产生的特异性IgE抗体，再以荧光标记的发展液与之结合，荧光强度的大小与待检特异性IgE的含量呈正相关。以WHO标定的IgE标准品含量的对数做横坐标，以荧光强度为纵坐标，绘制半对数曲线，由该曲线可以确定不同的荧光强度所对应的特异性IgE含量。PhadiaImmunoCAP检测过敏原的方法被认为是国际过敏原检测的公认标准，其他任何一种方法都要与其进行比较。我科于2011年购买了一台该型号的仪器，我们对该仪器的准确性、稳定性、重复性、线性等相关性能的进行了评价，现将检测结果报告如下。

1 仪器与方法

1.1 仪器 瑞典Phadia AB公司生产的Phadia 250全自动体外荧光免疫分析系统。

1.2 试剂ImmunoCAP特异性IgE质控品、ImmunoCAP特异性IgE校准品(条)0-100、ImmunoCAP特异性IgE酶标二抗、清洗液、底物液以及终止液等。所用试剂及质控品均为Phadia AB公司原装进口。

1.3 加样精度 分别对样本(sample)、发展液(development)和终止液(stop solution)加样量进行测试，按IDM软件中虚拟Immuno反应盘提示，将20个已称重量(G1)的检测Immuno-CAP放入反应盘中的正确位置，选择“Replicate”为20次。执行加样操作后，将检测CAP小心取出，并立刻称重(G2)。加样重量(G)按G=G2-G1。计算20次加样的均值和CV%，CV%应小于厂家声明的加样2%。

1.4 精密度 该方案在EP-5文件的关于精密度方案的基础上进行改良，取足够量的特异性IgE项目两个浓度(低值0.35 kUA/L、高值100kUA/L)的阳性质控品，每天做2批实验，批间的时间相差不少于2 h，每批的样品做双份检测，共做5 d实验。一共20个结果，每对结果间的差是每批的批内差。一天中每批双份结果的均值之间的差表示这一天的批间差。对这些批间差统计后，减去其中的批内差，成为真正的批间不精密度[1]。并按公式(1)计算变异系数(CV，%)，变异系数应符合厂商声明的要求，批内精密度(CV，%)≤5%，批间批间精密度(CV，%)≤5%。

1.5 准确性 ①阳性质控品:测试特异性IgE项目三个浓度的阳性质控品(0.35 kUA/L、17.5 kUA/L、100 kUA/L)，每个质控品测试2次，分别计算平均值，平均值应在标称范围内。并分别计算绝对偏差=测定值-靶值，相对偏差=绝对偏差/靶值×100%，因国际及厂家均无此项有关偏倚的声明，参照美国临床实验室修正法规(CLIA'88)规定的总允许误差[2]。允许偏倚设为15%。②阴性质控品:测试样本稀释液和0.35 kUA/L阳性质控品各2次，分别计算荧光响应值平均值，稀释液荧光响应平均值应＜0.35 kUA/L阳性质控品荧光响应值。

1.6 线性 将特异性IgE浓度为90kUA/L的标本(H)，混合均匀后，用专用 Diluent稀释液(L)按 H、1 h+5 L、2 h+4 L、3 h+3 L、4 h+2 L、5 h+1 L、L进行稀释，按浓度由高到低的顺序进行检测后，在按浓度由低到高的顺序进行检测。取各浓度水平的平均值。以稀释浓度(预期值)为自变量，以测定结果均值(实测值)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数。

1.7 携带污染率 取高浓度特异性IgE质控品(100kUA/L)和低浓度质控品(0.35kUA/L)各一份，先测定高值3次(H 1、H2、H 3)，再测定3 次低次(L1、L2、L3); 同样先测定高值3 次(H 1、H2、H3)，再测定3 次低值(L1、L2、L3)。按公式:K=[(L1-L3)/(H 3-L3)]计算携带污染率。按厂家声明，携带污染率应＜10-4。

1.8 报告范围 按照CLSI EP9-A2文件，随机选取无过敏史及风湿免疫性疾病史的健康体检志愿者20例(男、女各10例)作为参考个体，比较小样本参考区间和厂家提供参考区间之间的可比性。如果20例参考个体中不超过2例(或10%的结果)的观察值在厂家提供的参考区间之外，厂家提供的95%参考区间可以接受，也就是说，可以直接引用厂家提供的参考区间[3]。

2 结果

2.1 加样精密度 进入仪器“PIPETTE DISPENSING TEST”界面，分别选择样本(sample)、发展液(development)和终止液(stop solution)测试，按IDM软件中虚拟Immuno反应盘提示，将20个已称重量(G1)的检测ImmunoCAP放入反应盘中的正确位置，选择“Replicate”为20次。执行加样操作后，将检测CAP小心取出，并立刻称重(G2)。加样重量(G)按G=G2-G1。计算20次加样的均值和CV%。

样本(sample)、发展液(development)和终止液(stop solution)三种加样量的加样精度验证结果见表1。均小于厂家声明的加样CV% ＜2%。

表1 加样精度

2.2 精密度 按预定方案进行精密度验证，低值和高值定值质控精密度见表2和表3。

表1 低值(0.35kUA/L)精密度

表2 高值(100kUA/L)精密度

2.3 准确度 阳性定值质控准确度结果见表4。

表4 阳性定值质控验证结果

2.4 线性 将特异性IgE浓度为100的患者血清用专用“dilution”稀释后，按预定方案测定2次，各点平均浓度分别为0.35、8.99、36.6、57.3、71.3、85.3 和 92.5 kUA/L，其测定值与理论值的直线相关系数为0.987，R2=0.974，特异性IgE预测值与实测值散点图见下图。

2.5 携带污染率 高值和低值各次的平均值为:96.5 kUA/L、97.4 kUA/L、100 kUA/L、0.35 kUA/L、0.35 kUA/L、0.36 kUA/L。根据公式K=(L1-L3)/(H3-L3)计算携带污染率。特异性IgE的携带污染率为0.1×10-4。符合厂家声明相符。

2.6 报告范围 随机选取无过敏史及风湿免疫性疾病史的健康体检志愿者20名，采空腹血5 ml，测定血清中特异性IgE水平，0.35 kUA/L质控品的平均荧光响应值143。健康志愿者该项目荧光响应值除1例为174，其余均低于143，最小响应值为21。厂家提供的特异性IgE参考范围为＜0.35 kUA/L，20名志愿者中，有19例测定值在该范围之内。

3 结论

根据美国临床和实验室标准化协会(clin ica l and laboratory standards institute，CLSI)在 EP19-P中的注释，验证(demonstrat ion)是由医学检验部门进行，验证所使用系统获得预期性能方面的能力，并且验证实验的实验方案要求简便、实用、易于操作[4]。本实验除进行了精密度、准确度、线性范围及参考区间的验证外，还对仪器的加样精度、携带污染进行了验证，并以制造商仪器说明书和试剂说明书中声明的性能指标为验证目标或标准来判断验证实验的成功与否。

Phadia 250全自动荧光免疫系统由于其基于ImmunoCAP的特殊固相免疫反应设计。其加样精度的验证不同于其他免疫系统或全自动生化分析系统，必须依赖于检测ImmunoCAP进行称重。仪器右侧的加样针只进行40ul的样本或酶液的吸取，左边的加样针仅进行50ul的development和200ul的stop solution的吸取。并对相应体积进行了固定。本实验中，各种液体的加样量均符合相应要求。

Phadia250全自动体外检测系统是瑞典生产并提供试剂的全封闭性系统，提供了欧美人群的特异性IgE参考区间，所以只需要选择20个参考个体的样本进行验证，20例样本特异性IgE的荧光响应值仅有1例超出参考范围下限0.35的荧光响应值，其余均在此范围内，可以引用此参考区间作为本实验室特异性IgE的参考区间。

综上所述，Phadia250全自动体外检测系统测定特异性IgE的精密度、准确度、分析测量范围及参考范围性能均与厂家声明一致;此验证方案和实验方法简便可行，可用于其他项目的性能验证。

[1]冯仁峰.临床检验质量管理技术基础.第1版.上海科学技术文献出版社，2003:42.

[2]张秀明，温冬梅，袁勇.临床生物化学检验质量管理与标准操作程序.北京:人民军医出版社，2007:103.

[3]王凡，蒋红君.罗氏2010免疫分析仪检测甲胎蛋白的性能验证. 现代预防医，2012，39(15):3911-3914.

[4]张莉，吴炯，郭玮，等.医学检验检测系统应用前的性能评价.检验医，2006，21(6):560-563.