Th17细胞与重症肌无力发病及临床严重度相关性研究

王中魁 魏东宁 王卫 陈玉萍

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种T细胞辅助、抗体介导、补体参与的以神经肌肉接头传递障碍为特征的自身免疫性疾病，MG发病与乙酰胆碱受体自身抗体（anti－acetylcholine receptor autoantibodies，AChR－Ab）介导的体液免疫密切相关［1］。近年来研究发现免疫调节细胞参与MG发病。辅助性T细胞17（T helper type 17 cells，Th17细胞）是近年新发现的功能性CD4＋T辅助细胞亚群，可特异性表达促炎因子IL－17［2］，活化的 Th17细胞分泌IL－17A、IL－17F、IL－21、IL－22和TNF－α等细胞因子，通过诱发其他炎性因子、趋化中性粒细胞等炎性细胞促进炎性反应［3－4］。近年来研究证实Th17细胞参与多发性硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病发病［5－6］，而Th17细胞在 MG发病机制中的作用仍有争议。本研究根据胸腺病理进行分组，使用流式细胞术检测MG患者外周血Th17细胞比例，采用实时定量 RT－PCR（realtime reverse trancription polymerase chain reaction，Realtime RT－PCR）方法定量测定Th17细胞相关细胞因子IL－17、IL－1β、IL－6，IL－23、RORγ mRNA 转 录 水 平，采 用ELISA 检测IL－17、IL－1β、IL－6和IL－23表达，并分析患者外周血Th17细胞比例与MG病情严重程度评分间的关系，以探讨Th17细胞及其细胞因子在MG发病机制中的作用。

1 对象和方法

1.1 观察对象 选择2010－09－2011－12期间309医院重症肌无力中心治疗的确诊MG患者102例。MG根据典型的临床症状、新斯的明试验阳性或神经重复电刺激递减试验阳性确诊［7］。入组患者均行胸腺瘤／胸腺切除术＋脂肪清扫术。根据胸腺病理结果分为MG伴胸腺瘤组（MG with thymoma，TM）、MG 伴胸腺增生（MG with thymic hyperplasia，TH）、MG 正常胸腺组 （MG with normal thymus，NT）3组。健康对照组（healthy controls，HC）选择309医院体检中心健康体检志愿者32例，均无近期感染或自身免疫病史。各组之间性别、年龄间无统计学差异。各组临床资料见表1。

表1 各组MG患者临床资料

1.2 主要试剂和仪器 淋巴细胞刺激剂佛波酯（PMA）、离子霉素（Ionomycin）购自Sigma公司，莫奈霉素购自Enzo公司；PC5标记抗人CD4单克隆抗体购自Beckman coulter公司，抗人CD4抗体购自BD Biosciences公司，抗人IL－17A抗体及ELISA试剂盒购自eBioscience公司；细胞膜破膜固定试剂购自BD公司；反转录试剂盒购自MBI公司；乙酰胆碱受体抗体试剂盒购自R＆D公司。PCR引物（表2）由上海博亚生物技术公司合成；流式细胞仪购自Beckman Coulter FC500公司，Rotor gene 3000实时定量PCR仪来自Corbett公司。

1.3 方法

1.3.1 Th17细胞相关细胞因子mRNA转录水平及表达水平检测:在MG患者病情稳定期且未接受免疫抑制治疗及胸腺切除术前，抽取15mL静脉血。使用密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMCs）制成悬液。使用RNA抽提试剂盒分离mRNA，获得的总RNA使用反转录试剂盒反转录为cDNA，－80℃保存。以实时定量RT－PCR检测 MG 患者 PBMCs IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和ROR－γmRNA转录水平，以β－actin为内参基因，以细胞因子的mRNA转录水平与内参基因表达量的比值作为其mRNA相对转录水平。使用ELISA 试剂盒检测 MG 患者血清IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和 TGF－β细胞因子表达水平。

表2 Realtime RT PCR引物序列

1.3.2 流式细胞术检测PBMCs Th17细胞比例:将PBMCs密度调整至2×106／L。使用PMA 100 ng、离子霉素1μg和莫奈霉素2μmol／L共刺激5 h。以抗人CD4抗体染色15min，使用破膜试剂溶解细胞膜，使用抗人IL－17A抗体胞内染色20 min。使用流式细胞仪检测Th17／CD4＋T细胞比例。

1.3.3 MG临床严重程度评估:在MG患者未接受免疫抑制治疗及胸腺切除术前，使用美国重症肌无力协会QMG评分评价患者病情，并分析血清Th17细胞比例与QMG评分之间的相关性。使用抗人AChR－Ab试剂盒（检测范围20～500pmol／L）测定MG患者血清AChR－Ab水平。分析MG患者血清Th17细胞比例与血清AChR－Ab水平间的相关性。

1.4 统计学处理 采用SSPS 19.0软件进行分析。数据以均数±标准差表示。采用ANOVA进行多组间比较及组间两两比较，使用Pearson回归分析进行两因素相关回归分析。

2 结果

2.1 外周血Th17细胞比例 MG伴胸腺瘤患者外周血Th17细胞比例升高。MG伴胸腺瘤组〔（1.57±0.56）%〕显 著 高 于 对 照 组 〔（0.94±0.32）%，P＝0.031〕，对照组与 MG伴胸腺增生组〔（1.35±0.36）%〕及 MG 正常胸腺组〔（1.09±0.52）%〕之间差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 Th17细胞相关细胞因子mRNA转录量MG伴胸腺瘤患者IL－17A、IL－1β、IL－6、RORγ及IL－23mRNA相对转录水平高于对照组（表3）。

2.3 MG伴胸腺瘤患者血清细胞因子表达 MG伴胸腺瘤患者血清细胞因子IL－17A、IL－1β及IL－23表达水平高于对照组（表3）。各组IL－6表达水平无统计学差异（P＞0.05）。

表3 Th17细胞相关细胞因子表达及其mRNA相对表达量

2.4 MG伴胸腺瘤组外周血Th17细胞比例与QMG评分相关性 使用QMG评分评价MG患者临床严重程度，MG伴胸腺瘤组QMG评分与Th17细胞比例呈正相关（r＝0.74，P＝0.034），MG伴胸腺增生组（r＝0.51，P＝0.087）、MG正常胸腺组（r＝0.14，P＝0.41）Th17细胞比例与QMG评分不相关。

2.5 MG患者外周血Th17细胞比例与血清AChR－Ab水平相关性分析 102例MG患者中72例外周血AChR－Ab结果为阳性（＞20pmol／L），32例对照组均为阴性。各组AChR－Ab水平无统计学差异（P＞0.05）。MG患者血清AChRAb水平与Th17细胞比例（%）呈正相关（r＝0.81，P＝0.026）。

3 讨论

MG是一种以胸腺为靶器官的自身免疫性疾病［1］，近期研究证实细胞免疫缺陷参与 MG发病［8］。Th17细胞是近年来新发现的功能性CD4＋T辅助细胞亚群，特异性表达IL－17。人Th17细胞是在TGF－β和IL－1β共同诱导下由初始T细胞分化而来［9－11］。Th17细胞对于维持机体免疫耐受有重要调节作用，可参与多种自身免疫性疾病发病［5－6］。Th17 细 胞 及 其 相 关 细 胞因 子IL－17、IL－1β、IL－6和IL－23在 MG发病机制中的作用仍有争议。

IL－17是Th17细胞特征性标记因子，研究证实IL－17是一种促炎细胞因子，可上调趋化因子表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞至炎性反应部位，增强组织炎性反应［12］。本研究发现，MG伴胸腺瘤患者IL17mRNA和血清IL－17水平均显著增高，而正常胸腺 MG患者未发现类似改变，提示Th17细胞可能与胸腺瘤引起的免疫功能损伤紧密相关。细胞因子IL－23可调控IL－17表达，促进Th17细胞存活［9，13］。IL－1β可诱导人 ROR 表达，后者对于Th17的分化和发育具有重要意义［14］。因此，IL－1β和IL－23对于 Th17细胞的成熟和自稳有重要意义。本研究结果显示，MG伴胸腺瘤组组 RORγ、IL－23和IL－1β表达上调，提示IL－23和IL－1β可能是参与人Th17细胞诱导和自稳的主要因素。

在实验性自身免疫性重症肌无力（experimen－tal autoimmune myasthenia gravis，EAMG）模型中，Th17细胞比例明显增高，IL－17表达亦明显增加［15］，然而临床研究显示 MG患者外周血Th17细胞比例与健康对照无明显差异［16］。本研究结果显示伴胸腺瘤MG患者外周血Th17细胞比例显著升高，非胸腺瘤MG患者外周血Th17细胞比例与健康对照相比无明显差异，提示Th17细胞比例变化与胸腺瘤密切相关。最近一项研究证实，与眼肌型MG和健康对照相比，全身型MG患者外周血Th17细胞比例显著升高，且血清AChR－Ab水平与Th17细胞比例有相关性；不过入组该研究的25例MG患者，仅2例存在胸腺病变（2例IL－17水平均明显升高）［17］，因此该研究尚需临床观察更多伴胸腺异常的MG患者进一步验证。以往曾有研究证实伴发胸腺瘤MG体内自身反应性T细胞增多，可辅助 B 细胞产生自身反应性抗体［18－19］。本研究中伴胸腺病变的MG样本量较大，结果显示血清AChR－Ab与外周血Th17细胞比例呈正相关（r＝0.81，P＝0.026），由此推测Th17细胞可能通过影响B细胞生成自身免疫性抗体在MG发病中发挥作用，与上述研究结果相似。进一步分析血清Th17细胞比例与MG患者临床表现严重程度评分——QMG评分之间的关系发现，胸腺瘤组中QMG评分与Th17细胞比例正相关，提示Th17细胞仅与MG伴胸腺瘤病情严重程度相关。

总之，本研究结果显示，MG患者外周血Th17细胞与AChR－Ab水平呈正相关，MG伴胸腺瘤患者外周血Th17细胞数目和IL－17表达上调且与疾病严重程度相关。因此Th17细胞数目上调可能导致免疫耐受失衡，引发MG等自身免疫性疾病发病。本研究胸腺瘤各亚组样本量小，各亚组间Th17细胞未发现明显差异，需要通过后期研究进一步探索不同病理类型胸腺瘤患者Th17细胞差异，并需要进一步研究Th17细胞在MG发病中的具体机制和信号通路，这对于MG的诊断和治疗可能会有重要意义。

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