ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡作用分子机制研究

周春刚，陆 曙，王书乐，张志斌

（南京中医药大学无锡附属医院 中心实验室，江苏 无锡214001）

研究表明，致动脉粥样硬化的因素包括ANGⅡ、氧化修饰低密度脂蛋白及氧化应激反应等均能诱导内皮细胞凋亡。内皮细胞凋亡影响血管调节，致血管平滑肌细胞增殖和迁移，促进血液凝固，进而促进动脉粥样硬化斑块的形成与发展［1］。ANGⅡ作为内皮细胞的主要促凋亡因子，其诱导细胞凋亡机制尚未完全阐明，本文通过ANGⅡ诱导体外培养大鼠动脉内皮细胞株（RAOEC）细胞凋亡，探讨其诱导凋亡机制。

1 材料和方法

1.1 大鼠动脉内皮细胞细胞株（RAOEC R304－05）（上海拜力生物科技有限公司购买），DMEM高糖（GIBCO），10%FBS（GIBCO），4mM L－G（L－谷氨酰胺）（GIBCO），1mM 丙酮酸钠（GIBCO），0.25%胰酶 （GIBCO）AngiotensinⅡ5mg（美国ENZO），缬沙坦（北京诺华制药有限公司），PD123319（北京科海荣京生物科技有限公司），Annexin V／PI双染流式细胞凋亡检测试剂盒（美国BD），SYBR Prime－Script RT－PCR Kit Ⅱ 试 剂 盒 （TAKARA DRR083S），流式细胞仪（美国 BD），LightCycler480 PCR仪（德国 ROCHE），二氧化碳培养箱（美国NUAIRE）。

1.2 RAOEC细胞培养和处理 RAOEC细胞株生长在含有10%胎牛血清，4mM L－G，1mM丙酮酸钠，100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素的 DMEM高糖培养基中培养，37℃5%CO2的二氧化碳培养箱中传代培养。取对数生长期RAOEC细胞，每孔接种8×104个细胞，ANGⅡ（10－5M，10－6M，10－7M，10－8M，10－9M），10－7M ANGⅡ（6h、12h、18h、24 h、48h），10－5M 缬沙坦和10－5M PD123319实验组均设复孔，每个实验需重复3－4次。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 取1×106个细胞，1ml 4%多聚甲醛（PFA）固定20min，PBS洗2次，弃上清，沉淀细胞分2管，作为Annexin V和PI单阳性对照以调节荧光补偿。每个实验组细胞用冷PBS洗2次，0.25%胰酶消化处理，Annexin V 和PI标记后进行流式检测。

1.4 逆转录和实时荧光定量PCR及溶解温度曲线（Tm）分析 实时荧光定量PCR采用两步法，管家基因β－actin作为内参基因，目的基因和内参基因引物序列见表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。目标DNA扩增结束后再运行熔解程序，溶解曲线分析采用LightCycler Relative Quantification（Version 1.5）软件，用于产物的特异性分析，2%琼脂糖凝胶电泳亦用于扩增产物的大小及特异性鉴定。

1.5 相对定量分析 相对定量分析采△△CT法，标准化比值计算公式采用2－△△CT［2］。以未加 ANGⅡ对照孔细胞作为校准品（calibrator），实验组mRNA水平与校准品mRNA水平比较的相对比值作为定量值。

1.6 统计方法 数据统计采用统计软件SPSS11.5处理，数值用均数±标准差表示，两组间差异统计性分析采用Student’st－test，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测ANGⅡ诱导RAOEC细胞凋亡率 结果显示10－6M和10－7M ANGⅡ诱导内皮细胞24h凋亡率为20%－30%，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），而更高或者更低浓度的 ANG Ⅱ（10－5M，10－8M，10－9M）并没有引起更高的凋亡率。10－7M ANGⅡ诱导内皮细胞6h和48h凋亡率分别为（13.2±1.25）%和（16±2.11）%，而12h－24h凋亡率显著升高，凋亡率为25%－27%，差异具有统计学意义（P＜0.05），AT1R特异性受体拮抗剂缬沙坦干预ANGⅡ（10－7M）诱导内皮细胞凋亡组24h凋亡率为（19.28±2.23）%，AT2R特异性受体拮抗剂PD123319组凋亡率为（14.24±1.74）%，缬沙坦和PD123319联合干预内皮细胞凋亡率为（6.27±1.44）%，与未加拮抗剂的ANGⅡ组［凋亡率（34±1.86）%］差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 RT－qPCR产物电泳及Tm曲线分析（表1）目的基因及内参基因的PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增产物均为单一条带，无引物二聚体形成。扩增产物具有单一明显而尖削的峰图说明产物的特异性，不同的基因片段具有不同的Tm。每一个Tm对应一个溶解曲线峰。

2.3 RT－qPCR荧光相对定量凋亡信号转导途径相关分子mRNA表达水平（图1，图2）

与未加ANGⅡ的对照孔比较，10－7M ANGⅡ24hAT1R和AT2RmRNA表达水平显著上调，分别为2.48±0.562和2.14±0.290，Fas、caspase 8、caspase9和BAX mRNA表达水平显著上调，分别为2.058±0.234，1.93±0.377，2.022±0.157，2.037±0.035，差异具有统计学意义（P＜0.05）。FasL、Bcl－2、XIAP mRNA表达水平略有上调，相对值分别为1.602±0.592，1.298±0.342，1.216±0.272，细胞Fas－相关性死亡结构域样白介素－1β转换酶抑制蛋白（c－FLIP）mRNA 表达水平为1.044±0.189，但差异均不具有统计学意义（P＞0.05）。caspase8／c－FLIP比值 及Bcl－2／BAX比值分别为1.849±0.462和0.541±0.265，与未加 ANG Ⅱ的对照孔比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 ANGⅡ诱导RAOEC凋亡ATR及Fas／FasL死亡途径相关凋亡蛋白mRNA表达水平

图2 ANGⅡ诱导RAOEC凋亡ATR及胞内线粒体途径相关凋亡蛋白mRNA表达水平

表1 目的基因和内参基因引物序列及产物特征

3 讨论

细胞凋亡两个主要途径，胞外死亡受体途径和胞内线粒体途径，并不是孤立存在，不同水平受多种调控因子控制，多种促凋亡分子与抑制凋亡分子相互作用，构成多种分子共同作用的复杂调节网络［4］。在ANGⅡ诱导凋亡模型中，随凋亡率增加Fas和caspase 8mRNA 水平显著升高，caspase 8／c－FLIP比值升高，胞内线粒体途径中BAX、caspase 9mRNA水平显著上调，Bcl－2／BAX比值显著降低。由此可见，ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡与Fas、caspase 8、BAX和caspase 9上调有关，表明两个凋亡途径均有参与，而我们的研究结果尚需在蛋白水平进一步证实。

ANGⅡ的生物学作用依赖细胞类型的不同，通过活化其受体AT1R和AT2R促进生长或凋亡［5－9］。我们在对ANG Ⅱ诱导大鼠动脉内皮凋亡模型研究发现，ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮凋亡作用具有时间和剂量依赖性，高浓度和低浓度或者延长作用时间都不能增加凋亡率，与相关研究报道一致［10］，不同ANG Ⅱ浓度诱导凋亡率与AT1R和AT2RmRNA表达水平呈直线相关，随凋亡率增加，AT1R和AT2RmRNA表达水平上调，缬沙坦和PD123319分别单独干预后，凋亡率减低，AT1R和AT2RmRNA表达水平均显著下调，而单独应用均不能完全抑制ANGⅡ诱导内皮凋亡，可能是AT受体与相应拮抗剂结合后，ANGⅡ通过另一AT受体，起到促凋亡作用，而联合应用则能完全抑制其诱导的内皮细胞凋亡，结果表明AT1R和AT2R信号转导途径参与ANGⅡ诱导内皮凋亡。ANGⅡ作为RAAS系统重要的促凋亡因子，内皮细胞凋亡加速动脉粥样硬化的形成和发展，ANGⅡ受体拮抗剂可能通过保护内皮细胞，预防动脉内皮细胞凋亡导致血管重塑，抑制粥样斑块形成和发展。故阐明ANGⅡ在死亡信号传导通路级联关键调节点的作用机制，对寻找针对这些关键调节点具有特异性抑制作用药物或其他措施，为临床药物治疗和预防开拓思路具有重要意义。

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