土壤中昆虫病原线虫种群密度检测新方法

战丽莉，王 义，许艳丽，裴希超，刘振宇

(1. 中国科学院东北地理与农业生态研究所中国科学院黑土区农业生态院重点实验室，海伦农田生态系统国家野外观测研究站，黑龙江哈尔滨150081; 2. 黑河学院物理化学系，黑龙江黑河164300; 3.Rutgers University，New Brunswick NJ 08901－8520，USA; 4. 黑河出入境检验检疫局，黑龙江黑河164300;5. 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨150086)

0 引 言

昆虫病原线虫(Entomapathgenic Nematoda)是一类专性寄生土壤害虫的微小动物，属动物界、线虫门(Nematoda)、侧尾腺口纲(Secernentea)、圆线虫目(Rhabditida)，斯氏线虫科(Steinernematidae)和异小杆线虫科(Heterhabditidae)。昆虫病原线虫由于具备对害虫致死范围广、致死速度快、对人畜以及其它有益生物包括害虫天敌等无不良影响、对环境无污染以及易于规模化生产等优点，成为害虫生物防治的重要因子，被国内外广泛应用。昆虫病原线虫主要生活在土壤中，具有主动搜寻昆虫寄主的能力［1］。昆虫病原线虫可有效地控制钻蛀性害虫，对花生田地下害虫蛴螬防效可达到95%以上，效果明显好于辛硫磷的防治效果［2］，试验对大豆田地下害虫东北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)的幼虫进行防治，发现致死率同样达到95%以上［3］。但紫外光、部分病原微生物和捕食性天敌对昆虫病原线虫有抑制作用［4－6］，因此施用后昆虫病原线虫在土壤中的种群数量会随时间推移发生变化，进而影响昆虫病原线虫对害虫的防治效果。生产中线虫施用后在田间的密度、施用线虫地块存活数量等，对于评价线虫应用效果和线虫在土壤中定殖很重要，因此，对施入昆虫病原线虫的田块进行昆虫病原线虫密度检测是确保昆虫病原线虫防治害虫效果的重要手段，也是确定是否需要再次施入昆虫病原线虫的重要依据，同样也是研究过程中的追踪调查重要手段。而土壤中线虫种类繁多、数量巨大［7－8］，昆虫病原线虫仅为土壤线虫的一种类群［9］，前人对昆虫病原线虫定性和定量的监测方法有悬浮离心法［10］和诱集法［11］，悬浮离心法要将土壤样品带回实验室后进行相应的处理后进行一次离心和两次悬浮离心。诱集法同样要将土壤样品带回实验室进行诱集，诱集过程中需人工翻动诱集装置数次已达到最佳的诱集效果。这两种方法需进行田间取样，该过程会破坏农作物，另外在定量监测时采用大蜡螟诱集直至土样中没有线虫为止要花费很多时间，同时还要对被侵染的大蜡螟逐头解剖计数线虫，此过程费时费力。所以，准确、快速地确定检测土壤中昆虫病原线虫的密度是试验研究和线虫应用及技术指导中急需解决的问题，研究报道了土壤中昆虫病原线虫密度定量检测技术，该技术可方便、快捷、准确地检测土壤中昆虫病原线虫密度，并可有效地促进昆虫病原线虫试验研究和应用，为研究结果的实施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

昆虫病原线虫(Heterorhabditis bacteriophora)侵染期线虫(Infective Juveniles，IJ)由中国科学院东北地理与农业生态研究所农田有害生物控制实验室保存，试验用的大蜡螟(Galleria mellonella)属鳞翅目螟蛾科蜡螟亚科，其幼虫是昆虫病原线虫重要寄主之一，由于大蜡螟幼虫对昆虫病原线虫极为敏感的特点，人们常采用大蜡螟进行昆虫病原线虫分离、诱集、繁殖和对昆虫致病力测定［12］。研究用大蜡螟末龄幼虫(Galleria mellonella)购于天津惠裕德生物科技有限公司，昆虫病原线虫种群密度检测器为自制，并获得授权专利(ZL201010205217.8)。试验用灭菌土取自本所试验田耕层黑土，160 ℃下烘干2 h 灭菌备用。生物显微镜(Motic s633069)下昆虫病原线虫计数，试验用长方形塑料盒为32 cm × 23 cm × 15 cm。

1.2 方法

利用昆虫病原线虫依赖寄主昆虫繁殖并具有趋化性的特点，采用室内模拟试验方法，优化昆虫病原线虫对寄主昆虫大蜡螟的趋向时间，即昆虫病原线虫种群密度检测器的使用时间的确定，同时优化监测器之间的距离，确定最佳收集距离。利用昆虫病原线虫昆虫种群密度检测器检测土壤中昆虫病原线虫种群密度。

1.2.1 昆虫病原线虫收集时间优化。将4.5 kg 灭菌土装入长方形塑料盆中，加入511 ml 无菌水和102 ml的线虫悬浮液，使土壤湿度保持在12%。侵染期线虫(Infective Juveniles，IJ)按60 万IJ s·m－2接种线虫，将昆虫病原线虫种群密度检测器垂直插入塑料盒中。试验设接种线虫后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 5 个时间调查密度检测器内诱集到的线虫数量。收集进入到昆虫病原线虫种群密度检测器中的线虫悬浮液，显微镜下计数，每处理重复4 次，检测器间距为8 cm。

1.2.2 昆虫病原线虫密度检测器放置间距优化。试验用塑料盒设置同上，检测器放置之间的距离(两相邻管管心连线距离)为2 cm 、4 cm 、6 cm 、8 cm 和10 cm，48 h 收集，然后分别收集进入到昆虫病原线虫种群密度检测器中的线虫悬浮液，显微镜下计数，每处理重复4 次。

1.2.3 检测标准曲线的建立。优化收集时间及检测器间距后，在土壤中分别按10 万IJ s·m－2，20 万IJ s·m－2，40 万IJ s·m－2，60 万IJ s·m－2，80 万IJ s·m－2，100 万IJ s·m－2七个密度施入昆虫病原线虫的侵染期线虫，48 h 后收集检测器中管中收集到的昆虫病原线虫，并计数，依据管中昆虫病原线虫的数量和施入线虫的密度建立曲线，3 次重复。标准曲线的建立分别在2010 年1 月7 日、3 月18 日和4 月14 日进行试验重复，并依据3 次试验结果进行最终标准曲线的建立。

1.2.4 数据统计分析。采用Excel 进行数据基本处理，采用DPS v3.01 软件完成数据处理。利用one－way ANOVA 单因素方差分析多重比较(LSD)方法对不同处理数据进行差异显著性分析，差异显著水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 昆虫病原线虫收集时间优化

利用昆虫病原线虫对寄主大蜡螟的趋向性进行线虫密度检测，检测过程中发现昆虫病原线虫种群密度检测器收集时间的长短显著影响检测器中收集到的昆虫病原线虫的数量。在24 h 时昆虫病原线虫种群密度检测器就有线虫出现，线虫条数为27 条，见图1。在24 h 到120 h 区间线虫在密度检测器中的数量出现了两次高峰，即测定时间为48 h 与72 h 密度检测器中线虫条数分别为126 条和129 条，且48 h 与72 h两测定时间之间检测器收集到昆虫病原线虫数量差异较小，但与其他测定时间之间差异显著(p ＞0.05)，72 h 后密度检测器中线虫数量开始缓慢下降，直至96 h 之后密度检测器中线虫数量基本处于平稳阶段。分析原因可能是昆虫病原线虫需要一定的活动空间，且在检测器中昆虫病原线虫的数量达到一定程度即昆虫病原线虫在收集管中的密度达到一定的临界值时，因空间、氧气等外界条件的限致使昆虫病原线虫爬出，导致检测器中昆虫病原线虫数量降低。48 h 和72 h 两个收集时间之间昆虫病原线虫种群密度检测器中昆虫病原线虫数量差异不显著(p ＞0.05)，从节省时间以及试验的准确度上考虑，48 h 为昆虫病原线虫密度检测器的最佳收集时间。

图1 不同收集时间EPN 对大蜡螟趋性影响Fig.1 Effects of different collection time on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.2 昆虫病原线虫密度检测器间距优化

预试验中发现，病原线虫种群密度检测器对昆虫病原线虫的检测效率受检测器之间距离影响，因此，研究对昆虫病原线虫种群密度检测器施用间距进行了优化。在检测器间距为8 cm 时昆虫病原线虫种群密度检测器的收集数目达到最大，达18 条/管，显著高于间距为2 cm、4 cm、6 cm 和10 cm 时昆虫病原线虫种群密度检测器的收集数目，与其他4 个距离差异显著，见图2。当收集管之间的距离过近时昆虫病原线虫在一定范围内土壤中的数量有限，因此昆虫在每个检测器中收集到的数量较低。当检测器之间的距离过大时，寄主释放的信息物质浓度低于检测器间距小的情况。综合土壤中昆虫病原线虫的数量和寄主昆虫释放出的信息物质的浓度两种因素，认为昆虫病原线虫种群密度检测器的最佳使用间距为8 cm。

图2 不同距离EPN 对大蜡螟趋性Fig.2 Effect of distance between collection tubes on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.3 检测标准曲线的建立

2.3.1 标准曲线的建立。昆虫病原线虫检测器中收集到昆虫病原线虫的数量与盒外土壤中昆虫病原线虫的密度具有显著的相关性，因此通过3 次室内模拟试验建立昆虫病原线虫种群密度检测器中收集到的线虫数量和土壤中昆虫病原线虫密度的关系曲线，见图3。在标准曲线建立的3 次重复试验中，第一次和第三次结果表明土壤中昆虫病原线虫的密度和检测器中收集到的昆虫病原线虫的条数显著相关，且相关系数R2分别为0.902 4 和0.936 4。但在第二次标准曲线建立的重复试验中二者之间的相关系数R2仅为0.707 2，分析其中的原因可能为在进行第二次室内模拟实验时室内温度较低，前两次重复实验在正常室温下进行，室温范围在17 ℃～20 ℃之间，而第三次试验因天气原因，室内气温低于16 ℃，致使昆虫病原线虫的活动较缓慢。

2.3.2 最终标准曲线建立。综合3 次试验结果，建立最终大蜡螟对昆虫病原线虫趋性标准曲线，见图4。昆虫病原线虫检测器中收集到的昆虫病原线虫与土壤中昆虫病原线虫的密度显著相关，相关系数R2达到0.929 5。

4 讨 论

在利用昆虫病原线虫控制害虫时，研究者或植物保护工作者将昆虫病原线虫释放到田间进行害虫防治后，需要跟踪监测线虫在土壤中的存活情况以便决定下一次应用的必要性、应用时间及用量。研究方法在进行定性及定量试验时无需将土壤取回且不破坏田间作物，较前人研究的方法更快速简便。昆虫病原线虫的活动能力和侵染能力受到很多外界的影响，在外界环境因素出现变化的时候标准曲线也要重新建立，是否可以建立一个具有普遍适用性的标准曲线以减少实际操作时的步骤，是此方法有待改进之处。目前为止该技术在田间应用时应根据不同条件对标准曲线进行适当校正和调整后再进行田间应用。研究收集时间是在节省时间的前提下选定的，而在实际应用中应根据实验要求的不同对收集时间进行相应的调整，若以收集昆虫病原线虫为目的则应重新确定收集到昆虫病原线虫数量最多的时间，已达到收集量最大的目的。此方法只针对一种昆虫病原线虫进行试验，是否对其他品系的昆虫病原线虫有效还需要进一步实验确定。

图3 EPN 对大蜡螟趋性标准曲线Fig.3 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella

图4 EPN 对大蜡螟趋性标准曲线(最终)Fig.4 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella (Final)

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