紫叶稠李果实花色苷的抗氧化活性

冷 梅，刘 荣

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

紫叶稠李(Prunus virginiana)又名斑叶稠李，属蔷薇科(Rosaceae)稠李属(Padus)植物，产于北半球寒温带地区，喜光、耐寒、耐旱性强，具有很强的观赏性，落叶乔木，花期4～5月，果实球形，果实呈紫红色，果熟期8～9月，味涩微甜紫叶稠李含有丰富的花色苷[1]。目前国内外对紫叶稠李的研究集中在木苗繁育、叶片成分分析等方面[2]，对果实中的天然活性成分和抗氧化略有报道[3]，而对于紫叶稠李果实抗肿瘤的生理活性未见报道。

本实验以体外抗氧化和肿瘤细胞为体系模型，研究紫叶稠李果实花色苷的含量、体外抗氧化活性、作用于肿瘤细胞后，细胞内抗氧化酶和氧化产物的变化，为揭示紫叶稠李的生理功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫叶稠李果实采自哈尔滨双环园林采摘；细胞株人宫颈癌HeLa细胞、人结肠癌HT29细胞、人肝癌HepG2细胞 哈尔滨工业大学；三羟甲基氨基甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；胰蛋白酶 天津市灏洋生物制品有限责任公司；胚胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培养基、DMEM培养基 美国Gibco公司；Triton X-100 生兴生物技术(南京)有限公司；青霉素-链霉素 碧云天生物技术研究所；GSH-Px、CAT、SOD、MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所；其余所用试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 紫叶稠李果实花色苷的提取

将烘干紫叶稠李果实粉末以料液比1：20(m/V)加入60%乙醇浸提3h→500W超声30min→离心→提取液抽滤3次→旋转蒸发浓缩→回收浸提液→浸提液加入AB-8树脂→平衡吸附2h→用60%乙醇以2.0mL/min的流速洗脱→旋转蒸发浓缩→回收浸提液→冻干[4-7]。

1.2.2 花色苷含量的测定

采用pH示差法测定紫叶稠李果实中花色苷的含量[8]。稀释提取物分别用0.025mol/L，pH1.0的KCl缓冲液和pH4.5 CH3COONa缓冲液比例混合，分别在515nm和700nm波长处测定吸光度，以蒸馏水为空白比色。花色苷的含量按照公式(1)计算。

式中：A为吸光度，A =(A515nm－A700nm)pH1.0－(A515nm－A700nm)pH4.5；Mw为花色苷3-糖配基的分子质量(449.2D)；E为花色苷3-糖配基的摩尔吸收系数(26900L/(mol·cm))；ρ为缓冲液的质量浓度/(mg/mL)。每1g粉末中花色苷的含量用3-糖配基的毫克数表示。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力测定

参照文献[9]，依次向试管中加入8.62×10－2mmol/L DPPH乙醇溶液2mL，不同质量浓度的样液2mL，避光混合30min后于517nm波长处测定吸光度A1；同法操作，用等体积乙醇代替样液，测定吸光度A0；不加DPPH溶液，用等体积乙醇代替，加入不同质量浓度的样液，同法操作测定吸光度A2。每份样品平行操作3次，按照公式(2)计算清除率，并计算半数抑制质量浓度(IC50)。

1.2.3.2 ·OH清除能力测定

参照文献[10]，依次向试管中加入不同质量浓度的样液1mL，6mmol/L FeSO4溶液2mL，6mmol/L的H2O2溶液2mL，振荡摇匀，静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸2mL，静置30min后于517nm波长处测定吸光度A1；同法操作，用等体积蒸馏水代替样液，测定吸光度A0；不加水杨酸，用等体积蒸馏水代替，加入不同质量浓度的样液，同法操作测定吸光度A2。每份样品平行操作3次，按照公式(3)计算清除率，并计算IC50。

参照文献[11]，依次向试管中加入不同质量浓度的样液1mL，pH8.2的Tris-HCl缓冲液6mL，37℃水浴10min，再加入37℃预热过的7mmol/L的邻苯三酚盐酸溶液1mL，混合反应4min，用0.5mL浓盐酸终止反应，于325nm波长处测定吸光度A1；同法操作，用等体积蒸馏水代替样液，测定吸光度A0；不加pH8.20的Tris-HCl缓冲液，用等体积蒸馏水代替，加入不同质量浓度的样液，同法操作测定吸光度A2。每份样品平行操作3次，按照公式(4)计算清除率，并计算IC50。

1.2.3.4 过氧化氢清除能力测定

参照文献[12]，依次向试管中加入不同浓度的样液1mL，0.1mol/L的H2O2溶液1mL，质量浓度3g/100mL的钼酸铵溶液0.1mL，2mol/L的H2SO4溶液10mL，1.8mol/L的KI溶液7mL，混合后静置片刻。将混合液用5mmol/L的Na2S2O3溶液滴定至溶液的黄色消失，测定V1；同法操作，用等体积蒸馏水代替样液，测定V0；不加KI，用等体积蒸馏水代替，加入不同质量浓度的样液，同法操作测定V2。每份样品平行操作3次，按照公式(5)计算清除率，并计算IC50。

1.2.3.5 总还原能力测定

参照文献[13]，依次向试管中加入不同质量浓度的样液1mL，0.2mol/L pH6.6的PBS缓冲液2.5mL，质量浓度1g/100mL的K3Fe(CN)6溶液2.5mL，混匀后于50℃水浴20min，再加入体积分数为10%的C2HCl3O2溶液2.5mL，振荡混合后1000r/min离心10min。吸取离心后的上清液5mL于比色管中，依次加入蒸馏水5mL，0.1%的FeCl3·6H2O溶液1mL，混合后于700nm波长测定溶液吸光度A1；以蒸馏水代替不同质量浓度的样液，同法操作测定吸光度A0。每份样品平行操作3次，按照公式(6)计算总还原能力，并计算IC50。

1.2.4 细胞培养

人结肠癌HT29细胞株和人宫颈癌HeLa细胞株培养于RPMI-1640培养基(含10%灭活的胚胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，人肝癌HepG2细胞株培养于DMEM培养基(含10%灭活的胚胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)。37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，实验时取对数生长期细胞[14-16]。

1.2.5 细胞内GSH-Px、CAT、SOD活性和MDA含量测定

胰酶消化后，用含10%的胎牛血清培养液稀释成1.0×105个/mL，并吹打均匀，接种于24孔板，每孔1000μL，加药组设5个质量浓度，每个质量浓度设3复孔，同时设空白对照组。置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别加入质量浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的紫叶稠李果实花色苷100μL，同时对照组加入100μL的培养基，继续置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h后，取药物作用的细胞，用PBS洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化，制成细胞悬液，4000r/min离心5min收集细胞，再用PBS洗1遍，加入细胞裂解液(150mmol/L NaCl、150mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1% Triton X-100 pH 8.0)使细胞裂解，于4℃离心1h，以上清液作为样本，参照试剂盒说明书测定细胞内GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量。

1.2.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 紫叶稠李花色苷含量的测定

利用花色苷与黄酮的结构特性，当pH1.0时，在510nm波长处两者均有最大吸收峰，当pH4.5时，花色苷转化为无色查尔酮形式，在510nm波长无吸收峰，在700nm波长处有吸收峰，因此利用pH示差法测定紫叶稠李花色苷的含量为(0.830±0.033)mg/g。

2.2 体外抗氧化活性的测定结果

2.2.1 紫叶稠李果实花色苷对DPPH自由基的清除能力

图 1 紫叶稠李果实花色苷清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging capacity of the anthocyanins

由图1可知，紫叶稠李果实花色苷对DPPH自由基的清除率随质量浓度的增加而增强，并成明显的量效关系。以VC作为阳性对照，紫叶稠李果实花色苷清除率比VC低，当质量浓度为0.10mg/mL时，紫叶稠李花色苷的清除率为60.59%，VC的清除率为75.13%，可见紫叶稠果实李花色苷对DPPH自由基有一定的清除能力，紫叶稠李果实花色苷对DPPH自由基的清除率IC50为0.064mg/mL。

2.2.2 紫叶稠李果实花色苷对·OH清除能力

图 2 紫叶稠李果实花色苷清除·OH的能力Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging capacity of the anthocyanins

由图2可知，紫叶稠李果实花色苷对·OH的清除率随质量浓度的增加而增强，并成明显的量效关系。以VC作为阳性对照，紫叶稠李果实花色苷清除率比VC低，当质量浓度为10mg/mL时，紫叶稠李果实花色苷的清除率为77.84%，VC的清除率为90.24%，可见紫叶稠李果实花色苷对·OH有较强的清除能力，紫叶稠李果实花色苷对·OH的清除率IC50为1.320mg/mL。

图 3 紫叶稠李果实花色苷清除·的能力Fig.3 Superoxide anion free radical scavenging capacity of the anthocyanins

2.2.4 紫叶稠李果实花色苷对H2O2清除能力

由图4可知，紫叶稠李果实花色苷对H2O2的清除率随质量浓度的增加而增强，并呈明显的量效关系。以VC作为阳性对照，紫叶稠李果实花色苷清除率比VC低，当质量浓度为0.5mg/mL时，紫叶稠李果实花色苷的清除率为78.45%，VC的清除率为93.37%，可见紫叶稠李果实花色苷对H2O2有较强的清除能力，紫叶稠李果实花色苷对H2O2的清除率IC50为0.244mg/mL。

图 4 紫叶稠李果实花色苷清除H2O2的能力Fig.4 H2O2 scavenging capacity of the anthocyanins

2.2.5 紫叶稠李果实花色苷的总还原能力

图 5 紫叶稠李果实花色苷的总还原能力Fig.5 Total reducing power of the anthocyanins

由图5可知，紫叶稠李果实花色苷的总还原能力与质量浓度呈正相关。以VC作为阳性对照，紫叶稠李果实花色苷总还原能力比VC低，当质量浓度为0.25mg/mL时，紫叶稠李果实花色苷的总还原能力为0.547，VC总还原能力为1.789，可见紫叶稠李果实花色苷的总还原能力较弱。

2.3 细胞内抗氧化酶/物的检测结果

2.3.1 细胞内GSH-Px活性的检测结果

表 1 紫叶稠李果实花色苷作用72h后3种肿瘤细胞内GSH-Px活性Table 1 GSH-Px activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表1可知，紫叶稠李果实花色苷以质量浓度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa细胞72h后，3种细胞内GSH-Px的活性即出现下降趋势，随着紫叶稠李果实花色苷质量浓度的增大，GSH-Px的活性逐渐降低。当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.3mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.3mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度大于0.3mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.3mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.3mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异极显著。

2.3.2 细胞内CAT活性的检测结果

表 2 紫叶稠李果实花色苷作用72h后3种肿瘤细胞内CAT活性Table 2 CAT activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表2可知，紫叶稠李果实花色苷以质量浓度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa细胞72h后，3种细胞内CAT的活性即出现下降趋势，随着紫叶稠李果实花色苷质量浓度的增大，CAT的活性逐渐降低。当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.6mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.6mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度大于等于0.3mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度大于等于0.3mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异极显著。

2.3.3 细胞内T-SOD活性的检测结果

表 3 紫叶稠李果实花色苷作用72h后3种肿瘤细胞内T-SOD活性Table 3 T-SOD activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表3可知，紫叶稠李果实花色苷以质量浓度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa细胞72h后，3种细胞内T-SOD的活性即出现下降趋势，随着紫叶稠李果实花色苷质量浓度的增大，T-SOD的活性逐渐降低。当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.3mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.3mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.3mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.3mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度大于等于0.3mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异极显著。

2.3.4 细胞内MDA含量的检测结果

由表4可知，紫叶稠李果实花色苷以质量浓度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa细胞72h后，3种细胞内MDA的含量即出现上升趋势，随着紫叶稠李果实花色苷质量浓度的增大，MDA的含量逐渐升高。当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.6mg/mL和0.9mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.9mg/mL时，HT29细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.6mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.6mg/mL时，HepG2细胞与对照组的差异极显著；当紫叶稠李果实花色苷的质量浓度为0.6mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异显著，当质量浓度大于0.6mg/mL时，HeLa细胞与对照组的差异极显著。

3 结 论

本实验通过测定紫叶稠李果实李花色苷清除DPPH自由基、·OH、·、H2O2和总还原能力，并与VC对照来评价紫叶稠李果实花色苷的体外抗氧化能力，实验证明了紫叶稠李果实花色苷的体外抗氧化能力没有VC强，但在一定质量浓度条件下，对自由基的清除率都大于60%，仍然是一种较好的抗氧化剂。本实验还表明紫叶稠李果实花色苷作用于人结肠癌HT29细胞、人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌HeLa细胞72h后，GSH-Px、CAT、T-SOD活性显著降低，MDA含量显著升高。说明肿瘤细胞容易受到氧自由基和具有细胞毒性的MDA的损伤[17-18]。并且细胞内GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量变化与紫叶稠李果实花色苷存在质量浓度依赖关系。以上结果表明，抗氧化能力强的物质可清除细胞内的自由基，由于细胞内的自由基下降达不到平衡，导致抗氧化酶的活性下降，脂质过氧化产物的含量上升，这可能就引起了肿瘤细胞的死亡[19-21]。紫叶稠李果实花色苷对肿瘤细胞内抗氧化酶活性和氧化产物含量有影响，但紫叶稠李果实花色苷的质量浓度在什么范围内对肿瘤细胞抗氧化酶活性和氧化产物含量的影响最大，以及对正常细胞的影响如何还有待进一步研究。

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