低氘白酒对人肺腺癌细胞的抑制作用

张亚茹，沈才洪，郑有丽，卢中明，敖宗华，丛峰松,*

(1.上海交通大学生命科学与技术学院，上海 200240；2.四川泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000)

长期以来，酒精在肿瘤发展过程中所扮演的角色一直是不清楚的[1]。通常，白酒本身被认为是具有致癌性的。Mufti等[2]提出，在化学性的诱导食道癌过程中，白酒作为一个促进剂出现，但是在这个过程开始之前以及开始期间，它又抑制了肿瘤的发生率。Hayashi等[3]认为，慢性白酒促进了1,1-二甲肼所诱导的结肠癌的生成，进一步证实了Mufti等的观点。然而，杨连君等[4]认为，低剂量乙醇能够明显地诱导HCC-9204肝癌细胞凋亡。目前，白酒与肿瘤的关系还没有定论。

在自然界，水由2个氢原子和1个氧原子组成，其中氢元素有氕、氘和氚3种同位素。在地表水中，氘和氕的比率大约是1：6600，即水中氘的体积分数为0.015%[5]。通常把氘体积分数低于0.015%的水称为低氘水(DDW)。关于DDW的抑制肿瘤研究方面，Somlyai等[6]报道，DDW可以抑制小鼠成纤维L929细胞的生长速率和引起移植瘤小鼠肿瘤组织消退。俄罗斯研究人员最近发现，如果把普通水中氘的体积分数减少65%，就会表现出一定的抗肿瘤特性，抑制瘤小鼠实验结果也显示，DDW能抑制肿瘤生长，延长小鼠存活期[6-8]。本课题的研究也进一步证实，氘体积分数为0.0050% DDW在体内外均可抑制肿瘤的生长[9]。

中国白酒与水的关系密切。选择合适的发酵用水或加桨降度以提高酒的品质，降低白酒对人体的危害性，一直以来是人们关注的问题。本实验从体内、外实验探讨了低氘水、白酒以及低氘白酒对人肺腺癌细胞生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

BALB/c裸鼠60只，5～6周龄，雄性，(20±2)g，购自必凯实验动物有限公司[动物合格证号SCXK(沪)]。饲养于上海交通大学药学院实验动物中心SPF级动物房，室温25℃，湿度40%～70%之间，自由进食与饮水。

白酒由泸州老窖股份有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

人肺腺癌细胞株H460 上海市中国医学科院细胞研究所；人肺癌细胞株A549 中国科学院细胞库。DDW(体积分数0.0050%) 上海池天超轻水生物工程有限公司；胎牛血清 杭州四季清公司；RPMI1640培养基 美国Gibco公司；MTT、TUNEL和Anexin-Ⅴ试剂盒 南京凯基生物公司。

Multiskan MK3型酶标仪 美国Thermo公司；倒置显微镜 日本尼康公司；HF151UV CO2培养箱 立申仪器有限公司；超净工作台(净化效率100级) 瑞士梅特勒-托利多公司；FACSCalibur流式细胞仪型号 美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人肺癌细胞株A549和H460分别在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、5% CO2、37℃条件下培养。实验中，细胞种植于培养瓶中，90%的细胞汇合时，用于实验。

1.3.2 MTT法

A549细胞(104个/孔)接种于96孔培养板中。共分为4组，空白组：由正常1640培养基培；白酒组：在正常培养基中加入0～300mmol/L酒精，设置不同的酒精浓度梯度，以便测出最佳酒精作用浓度；DDW组：氘体积分数为0.00050%；DDA组：DDW配制的培养基中含0～300mmol/L的酒精。不同组别培养A549细胞24、48、 72h，分别加入50μL MTT试剂溶液继续培养4h后，吸净培养液后每孔加150μL DMSO，振荡10min，选择550nm波长，测定各孔的OD值。每组设5个复孔。

1.3.3 TUNEL法检测细胞凋亡

空白组、白酒组(含180mmol/L酒精)、DDW组以及DDA组(含180mmol/L酒精)培养A549 细胞48、72h。阴性对照组：正常条件下培养，标记过程中不加TDT Enzyme。阳性对照组：A549细胞用1000U DNaseⅠ反应液处理。按照试剂盒说明进行操作，选择苏木素进行复染。光学显微镜观察，细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结构，可见核染色质呈新月型，或者核碎裂成大小不等的核碎片，即典型凋亡的形态学改变。每张片子随机计数200个细胞，计算凋亡率。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

培养A549细胞48、72h，收集空白组、白酒组、DDW组以及DDA组的细胞。用PBS洗两次，用不含EDTA的胰酶消化细胞，约1～2min后终止消化。离心收集细胞，用PBS洗2次后弃上清，加500μL Binding Buffer悬浮，加5μL PI后混匀，再加入5μL FITC混匀，避光反应10min，上机检测。

1.3.5 人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型的建立和分组

将裸鼠随机分为6组：空白组、白酒低剂量(CL)组(V(白酒)：V(超纯水)=1：5.7)、白酒高剂量(CH)组(V(白酒)：V(超纯水)=1：3)、DDW组、DDA低剂量(DDAL)组(V(白酒)：V(DDW)=1：5.7)、DDA高剂量(DDAH)组(V(白酒)：V(DDW)=1：3)，每组10只。DDW组、DDAL组和DDAH组，提前饮用灭菌DDW，其他3组正常饲养。2周后，收集人肺癌细胞H460株，调整密度为1×107个/mL，用1mL注射器取上述细胞悬液0.2mL(含细胞数目2×106个)，注射于裸鼠右腋部皮下，即完成裸鼠肿瘤接种。

1.3.6 给药情况及样本的采集

造模当日灌胃，每天灌胃1次，每次0.2mL。25d后，采血后断颈处死荷瘤裸鼠，剥取皮下实体瘤瘤块，剔除筋膜，用电子天平分别称质量。计算各组瘤质量和抑瘤率。－70℃保存小鼠肺、肝、肾、脾以及瘤体，后续以备进行病理以及蛋白检测之用。

1.3.7 肿瘤生长情况及抑瘤效果的观察

造模10d，每3d测量瘤体的最长径(a)和最短径(b)，根据式(2)计算肿瘤体积(V)，绘制肿瘤生长曲线。最后一次灌胃24h后剥离瘤体，按公式(3)计算抑瘤率。

1.3.8 HE染色

取血后，颈椎脱臼处死动物，取瘤体、肝、肺组织于4%中性甲醛固定、取材、脱水、石蜡包埋、4μm厚切片、HE染色、封固，光镜条件下进行病理学观察。

1.4 统计学处理

采用SPSS 统计软件包进行数据分析，采用单因素方差分析，两组间的差异比较，以P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度酒精对A549细胞增殖的影响

图 1 不同酒精浓度与A549细胞增殖的关系Fig.1 Effect of alcohol on the proliferation of A549 cells

已知高剂量的白酒对细胞有损伤作用，本研究首先确定体外实验白酒的剂量。由图1可知，在酒精浓度为180、200mmol/L处，细胞的增殖率几乎相等，分别为88.429%、88.943%，而酒精浓度超过200mmol/L时，细胞增殖随着酒精浓度的增加被抑制，因此体外MTT的酒精浓度范围确定为150～200mmol/L。

在上述初定范围内，分别选取150、180、200mmol/L 3个不同酒精浓度，进一步确定最佳细胞增殖抑制浓度。

由图2A可知，与空白组比较，DDW组、白酒组(含150mmol/L酒精)及DDA组(含150mmol/L酒精)细胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h时，DDA组(细胞增殖率为(71.88±2.47)%与白酒组(细胞增殖率为(91.81±3.70)%)比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；DDA组与DDW组(细胞增殖率为(72.96±1.22)%)比较，无显著性差异。

由图2B可知，与空白组比较，DDW组、白酒组(含180mmol/L酒精)及DDA组(含180mmol/L酒精)细胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h时，DDA组(细胞增殖率为(70.58±2.73)%)与白酒组(细胞增殖率为(94.36±3.31)%)比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。DDA组与DDW组(细胞增殖率为(72.96±1.22)%)比较，无显著性差异。

由图2C可知，与空白组比较，DDW组、白酒组(含200mmol/L酒精)及DDA组(含200mmol/L酒精)细胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，DDA组与白酒组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在48h时，DDA组(细胞增殖率为(77.50±2.00)%)与DDW组(细胞增殖率为(81.25±0.72)%)比较，无显著性差异。

图 2 3种不同酒精浓度对A549细胞增殖的影响Fig.2 Effect of alcohol concentration on the proliferation of A549 cells

含酒精180mmol/L的白酒组、含酒精150mmol/L的白酒组与含酒精200mmol/L的白酒组比较，前者对细胞增殖抑制作用介于后两者之间，故本研究选定180mmol/L酒精浓度进行后续体外实验。

2.2 TUNEL 法检测DDA对A549 细胞凋亡的影响

TUNEL检测显示，DDW、DDA以及白酒作用A549 细胞48、72h后，引起细胞出现典型的细胞凋亡特征(图3)。空白组细胞的凋亡率为(8.468±1.203)%，阳性对照组细胞凋亡率为(36.762±2.733)%。DDW组、白酒组以及DDA组与空白组比较，能显著诱导细胞凋亡，差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时，DDW组以及DDA组与白酒组比较，能显著促进细胞凋亡(P＜0.05)。DDA组与白酒组比较，细胞凋亡更加显著(P＜0.05)。随着时间的推移，相同浓度白酒组之间，凋亡率增加(图4)。

图 3 TUNEL法检测DDA诱导的细胞凋亡(×400)Fig.3 DDA-induced apoptosis of A549 cells evaluated by TUNEL method (×400)

图 4 图片显示TUNEL数据Fig.4 Plot of the TUNEL data

2.3 流式细胞仪检测DDA引起的A549细胞凋亡

用DDW、DDA和白酒组分别培养A549细胞，48h后收集处理，上机检测细胞凋亡情况，如图5所示。

图 5 流式细胞仪检测DDA诱导的细胞凋亡Fig.5 DDA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay

表 1 流式细胞仪检测DDA诱导细胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

表 1 流式细胞仪检测DDA诱导细胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

组别48h72h空白组2.23±0.211.45±0.20 DDW组2.64±0.172.58±0.15白酒组4.59±0.236.99±0.39 DDA组4.04±0.145.80±0.54

由表1可知，作用48h时，空白组细胞凋亡率为(2.23±0.21)%，DDW组细胞凋亡率为(2.64±0.17)%，白酒组凋亡率为(4.59±0.23)%，DDA组凋亡率为(4.04±0.14)%。作用72h后则各组凋亡率与48h的各组凋亡率无明显变化。

2.4 DDA对肺癌移植瘤生长的抑制

治疗前各组裸鼠生理状态无明显差异。由图6可知，灌胃9d后，各组肿瘤体积均有所增长，除CH组与空白组外，其他各组肿瘤的生长速度明显缓慢。其中DDAL组瘤体生长最为缓慢，其次是DDW组，接着是DDAH组和CL组。由表2可知，DDAL组抑瘤率为31.014%，DDW组抑瘤率为27.639%，与空白组比较，差异具有统计学意义。CH组对移植瘤生长具有促进作用。

图 6 肺癌移植瘤生长曲线Fig.6 Growth curve of xenograft with lung cancer cells

表 2 裸鼠移植瘤体积以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

表 2 裸鼠移植瘤体积以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

注：*.与空白组比较有显著性差异(P＜0.05)。

组别数量瘤体体积/cm3抑瘤率/%空白组102.56±0.56 DDW组101.85±0.1327.639*DDAL组101.77±0.2331.014*DDAH组92.14±0.6616.531 CL组102.05±0.1319.584 CH组102.75±1.26－7.64

2.5 HE染色观察移植瘤、肺、肝组织病理变化

图 7 HE染色法检测肿瘤组织的病理变化(×100)Fig.7 Pathological change of tumor tissues with HE staining (×100)

由图7可知，空白组中肿瘤细胞排列密集，组织生长活跃(图7D)。相比较之下，DDW组与DDAL组，肿瘤细胞周围有坏死的组织，肿瘤细胞的数量明显低于空白组(图7A、B)。而CL组和DDAH组与空白组比较，肿瘤细胞排列更为松散，有坏死的肿瘤细胞(图7C、E)。CH组中肿瘤细胞排列紧密，切片显示肿瘤组织中有血管，癌细胞生长旺盛(图7F)。

图 8 HE染色法检测肺组织的病理变化(×100)Fig.8 Pathological change of lung tissues with HE staining (×100)

由图8裸鼠肺部组织HE染色可知，空白组中小鼠肺部正常无肿瘤病灶产生，肺部有完成的肺泡，肺泡管及肺泡囊、肺泡和肺泡之间的间隔正常(图8D)。其余各组的肺泡结构与空白组比较，无病理变化(图8A～F)。

图9裸鼠肝脏组织HE染色显示，空白组中小鼠的肝脏结构正常，肝细胞形态，大小结构正常，肝细胞排列整齐，细胞间界限清晰(图9D)。其余各组的肝部结构与空白组比较，无病理变化(图9A～F)。

图 9 HE染色法检测肝组织的病理变化(×100)Fig.9 Pathological change of liver tissues with HE staining (×100)

3 讨 论

通过实验研究证实，低剂量低氘白酒在体内外均能显著抑制人肺腺癌肿瘤细胞的生长。MTT结果显示，与同浓度的白酒组比较，低氘白酒能显著抑制肺癌细胞A549的生长。TUNEL法检测表明低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549细胞凋亡。其中，低氘白酒比白酒组诱导凋亡更显著。同时，随着时间的推移，凋亡率增加。流式细胞术检测进一步证实低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549细胞凋亡，与正常组比较，低氘白酒诱导了更多的凋亡。目前认为，酒精抑制肿瘤细胞生长的可能性机制为：1)导致细胞染色体受到损伤，DNA发生断裂，DNA修复酶的功能受到抑制[10]；2)致使细胞内电子传递链收到损伤，ATP合成的功能受到损害，激发脂质的过氧化，促使细胞内生物膜的流动性发生改变[11]；3)酒精代谢产生的中间产物，潜在的造成细胞的损伤，影响细胞的增殖。已有的研究表明[9]，低氘水主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡发生作用的。在体外，低氘水和酒精共同促进了肿瘤细胞凋亡。

在体内实验中，发现高剂量白酒促进肿瘤生长，而低剂量白酒抑制肿瘤生长。已有的研究指出[12]长期摄入酒精能增大肿瘤并增加血管生成因子和血管内皮生长因子(VEGF)的水平。研究还发现，低剂量的低氘白酒能显著抑制裸鼠移植瘤的生长，且与空白组比较，具有显著性差异，并且较其他实验组抑瘤效果好。病理观察显示，低氘白酒组瘤组织细胞排列松散，并发现有坏死肿瘤细胞。体内实验结果表明，低氘水与白酒联合使用具有协同作用进一步抑制了肿瘤细胞生长。

肝、肺病理切片显示，低氘水组和低氘白酒组小鼠的肝、肺组织正常，无明显病理变化，与Kovacs等[13]的结论一致。未来抗肿瘤药物的研究方向将是高效低毒，因此低氘水具有进一步深入研究的价值。

[1] MUFTI S I, ESKELSON C D, ODELEYE O E, et al. Alcoholassociated generation of oxygen free radicals and tumor promotion[J]. Alcohol & Alcoholism, 1993, 28(6)： 621-638.

[2] MUFTI S I, BECKER G, SLIPES I G. Effet of chronic dietary ethanol consumption on the initiation and promotion of chemically-induced esophageal carcinogenesis in experimental rats[J]. Carcinogenesis, 1989, 10(2)： 303-309.

[3] HAYASHI N, TSUTSUMI M, FUKURA M, et al. Effect of chronic dietary ethanol consumption on colonic cancer in rats induced by 1,1-dimethylhydrazine[J]. Alcohol Clin Exp Res, 2007, 31(Suppl 1)： 72-76.

[4] 杨连君, 王文亮. 乙醇诱导肝癌细胞凋亡及其相关蛋白的研究[J]. 中国肿瘤临床与康复, 2001, 8(2)： 3-5.

[5] SINIAK I E, TURUSOV V S, GRIGOREV A I, et al. Consideration of the deuterium-free water supply to an expedition to Mars[J]. Aviakosam Ekolog Med, 2003, 37(6)： 60-63.

[6] SOMLYAI G, JANCSO G, JAKLI G, et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells[J]. FEBS, 1993, 317： 1-4.

[7] TURUSOV V S, SINIAK I E, GRIGOR’EV A I, et al. Low-deuterium water effect on transplantable tumors[J]. Vopr Onkol, 2005, 51(1)： 99-102.

[8] TYRYSOV V S, SINIAK I E, ANTOSHINA E E, et al. The effect of preliminary administration of water with reduced deuterium content on the growth of transplantable tumors in mice[J]. Vopr Onkol, 2006, 52(1)： 59-62.

[9] CONG Fengsong, ZHANG Yaru, WANG Juyong, et al. Deuteriumdepleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2010, 1： 277-283 .

[10] DUDLEY B F, BRIMFIELD A A, WINSTON G W. Oxidation of thiodiglycol (2,2’-thiobis-ethanol) by alcohol dehydrogenase： comparison of human isonzymes[J]. J Biochem Mol Toxicol, 2000, 14(5)： 244-251.

[11] NAVASUMRIT P, WARD T H, DODD N J, et al. Ethanol-induced free radicals and hepatic DNA strand breaks are prevented in vivo by antioxidants： effects of acute and chronic ethanol exposure[J]. Carcinogenesis, 2002, 21(1)： 93-99.

[12] TAN W, BAILEY A P, SHPARAGO M, et al. Chronic alcohol consumption stimulates VEGF expression, tumor angiogenesis and progression of melanoma in mice[J]. Cancer Biol Ther, 2007, 6(8)： 1211-1217.

[13] KOVACS A, GULLER I, KREMPELS K, et al. Deuterium depletion may delay the progression of prostate cancer[J]. Journal of Cancer Therapy, 2011, 2： 548-556.