荧光定量PCR在大肠杆菌O157:H7检测中的应用研究进展

王力均，许恒毅*，熊勇华，李 萍

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

大肠杆菌O157：H7是近30a来才被发现和识别的食源致病菌，按血清型分类属肠出血性大肠杆菌(entero hemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。它以食物传播为主，主要的宿主是牛和鸡等家畜家禽。人类摄入不到10个活菌就有可能引起出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒综合症(hemolytic uremie syndrom，HUS)[1]，患者病死率极高，其对人类的健康构成了严重的威胁[2]。自1982年美国首次爆发大肠杆菌O157：H7引起的感染性腹泻以来，世界各国相继爆发了多起大肠杆菌O157：H7的流行事件。1986年在中国江苏徐州首次报道了大肠杆菌O157：H7的病例，随后在中国十几个省份也发生散发病例。其流行性已经不再是个别国家的问题，而是成为世界重要公共卫生问题之一[3]。

检测大肠杆菌O157：H7方法有常规培养法和免疫磁珠捕获法等[4]，常规培养法耗时且工作量大；免疫磁珠捕获法由于方法自身的局限性，检测的灵敏度低且造成一定程度的漏检。荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出。该方法弥补了传统PCR技术的不足，具有特异性好、灵敏度高、重复性强、定量准确、自动化程度高和速度快等优点，并且实现了PCR从定性到定量的飞跃。凭借上述优势，该技术迅速应用于临床和生物学研究等领域，尤其在大肠杆菌O157：H7检测中的应用已较为广泛，本文就荧光定量PCR技术在大肠杆菌O157：H7检测中的应用进行综述，旨在为基于荧光定量PCR方法检测大肠杆菌O157：H7提供一定的参考。

1 荧光定量PCR的原理

荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，最后通过已知浓度的标准样品制作的标准曲线，对未知浓度的样品进行定量分析的技术。

通常在荧光定量PCR反应过程中，要设定一定的荧光信号的阈值(threshold)，可用样本的阈值循环数Ct(C代表循环，t代表阈值)[5]表示，即每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[6]。采用不同浓度的标准样品的DNA为模板进行荧光定量PCR的扩增，可得到标准模板PCR的扩增曲线；再利用扩增曲线绘制出标准曲线，由标准曲线根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出样品的起始拷贝数[7]。

2 荧光定量PCR在大肠杆菌O157:H7检测中的应用

依据荧光定量PCR监测过程中检测模式的不同，荧光定量PCR可以分为SYBR GreenⅠ检测模式、水解探针模式和杂交探针模式。其中杂交探针模式又分为分子信标技术法和双杂交探针法。

2.1 SYBR GreenⅠ检测模式

SYBR GreenⅠ是一种高灵敏的荧光染料。当PCR的一个扩增循环完成时，形成脱氧核糖核酸(DNA)，SYBR GreenⅠ嵌合于双链DNA双螺旋小沟区域，发射荧光信号，而没有结合双链DNA的SYBR GreenⅠ则不发射荧光信号。随着循环的进行，扩增产物DNA增加，荧光信号同步等比例增强。因此，SYBR GreenⅠ的荧光信号强度与扩增产物双链DNA的数量有关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，从而达到评估模板DNA量的目的。目前，此技术是大肠杆菌O157：H7检测常用的模式，表1总结了SYBR GreenⅠ检测模式在检测大肠杆菌O157：H7时常用的引物。

表 1 SYBR Green Ⅰ检测模式在检测大肠杆菌O157:H7中常用的引物Table 1 Primers used for the detection of E. coli O157:H7 with SYBR Green Ⅰ mode

与普通PCR相比，快速和灵敏度高是该检测模式的优点之一。Lee等[8]对生菜的大肠杆菌O157：H7进行检测时，用皂土包被的活性炭除去生菜中可能存在的PCR抑制剂，使检测灵敏度从1×103CFU/g降低到5CFU/g。常规PCR方法从细菌DNA提取、PCR到电泳至少需要6h左右，而胡慧等[9]针对大肠杆菌O157：H7建立的荧光定量PCR方法整个检测只需要3h，灵敏度可达20CFU/mL。在实际样品模拟中检测限低至100CFU/mL。另一个优点是SYBR GreenⅠ是一种荧光染料，没有特异性，适用于所有的DNA模板，相比于其他模式，该模式更加简单方便且价格低廉。

由于SYBR GreenⅠ能和任何DNA双链结合发光，使得PCR扩增中产生非特异性扩增或者形成的引物二聚体产生荧光，导致假阳性发生，成为用SYBR GreenⅠ染料的荧光定量PCR检测方法的不足之处。对此可以借助融解曲线来区分非特异性产物和引物二聚体，从而排除假阳性。Yoshitomi等[10]在检测大肠杆菌O157：H7/H―基因stx1、stx2和uidA的研究中，利用融解曲线结合琼脂糖凝胶电泳，分析了用单个基因或多个基因扩增目的片段时，没有形成引物二聚体或非特异性的扩增。此外，也可以通过设计特异性引物，优化PCR反应条件，减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生，以提高检测方法的特异性。

2.2 水解探针模式

表 2 TaqMan荧光定量PCR技术在检测大肠杆菌O157:H7中常用的引物和探针Table 2 Primers and probes used for the detection of E. coli O157:H7 with TaqMan qPCR

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，两端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团，报告荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。其序列与两条引物中间包含的一端DNA片段配对。当探针与靶序列配对时，报告荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。进行扩增时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光，从而荧光检测系统可接收到荧光信号。一条DNA单链的合成就伴随着一个荧光分子的释放。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此TaqMan探针是检测积累荧光。目前，此模式在大肠杆菌O157：H7检测中应用有较多的报道，表2总结了采用水解探针模式荧光定量PCR检测大肠杆菌O157：H7时常用到的引物和探针。

TaqMan荧光定量PCR技术与普通PCR相比，具有灵敏度高、特异性好和检测周期短等优点。Weagant等[12]将荧光定量PCR方法结合磁珠分离技术，在检测金花菜中的大肠杆菌O157：H7时能将灵敏度降至0.2CFU/g，有效地避免了实际样品的漏检，提高了检测效率。Fu等[13]用偶联抗大肠杆菌O157：H7抗体的磁珠捕获菌后进行检测，特异性达到100%，非O157抗原的大肠杆菌均没有发生交叉反应。在牛肉馅样品模拟检测中用磁珠直接从样品中捕获大肠杆菌O157：H7，减少了牛肉馅中抑制剂对PCR的影响，同时省略了样品富集步骤，缩短了检测时间。而与传统培养方法相比，该方法运用自动化系统在4～5h完成，大大地提高了检测的效率。Kawasaki等[14]报道了多重荧光定量PCR在同一反应体系中检测沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的方法，灵敏度都达到102CFU/mL，缩短了检测时间和节省了成本，有效地提高检测效率。Sharma[15]采用多重荧光定量PCR方法同时检测大肠杆菌O157：H7的rfbE和eae基因，分别设计了2对引物和2个探针，提高了结果的准确性，同时为了避免死菌的假阳性干扰，采用了反转录的cDNA为模板。在供试的9株参考菌株中，2株大肠杆菌O157：H7均出现良好的阳性结果，其余菌株均呈现阴性结果，该方法能有效地防止错检，大大提高了结果的准确性。从牛粪分离的细菌经过5h富集培养，检测灵敏度达到5.1×10-1CFU/g牛粪，结果表明该方法检测仅需12h(包括富集时间)，比传统的细菌培养方法更加省时省力。Suo等[16]添加了1条人工合成的扩增内标片段，以指示检测中出现的假阴性，提高检测的准确率，他们还结合使用选择性富集沙门氏菌、大肠杆菌和李斯特菌的共增菌培养基使牛肉馅中大肠杆菌O157：H7的灵敏度低于18CFU/10g。Elizaquível等[18]对新鲜蔬菜中的大肠杆菌O157：H7检测时，用叠氮溴化丙锭(PMA)处理样品中的菌，由于PMA能够透过死菌的细胞膜和DNA结合并交联，形成共价碳氮键，抑制死菌DNA在PCR时的扩增，提高了荧光定量PCR检测的准确性，防止了因存在死菌造成的假阳性。虽然TaqMan荧光定量PCR技术优点甚多，然而所需试剂价格昂贵成为不能普及的主要原因。

2.3 杂交探针模式

2.3.1 分子信标技术法

分子信标(molecular beacon)是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，是TaqMan探针的衍生形式。在分子信标的结构中，环一般为15～30bp，并与目标序列互补；茎部的核苷酸相互配对，一般5～7bp。在茎环结构3’末端标记荧光基团，其5’末端则标记淬灭基团。由于两端的核苷酸序列互补配对，标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，因此荧光基团被激发后产生的荧光光子被淬灭基团淬灭。在PCR反应体系的复性阶段，环序列将与模板配对，互补的茎环双链解开，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭基团分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出荧光信号，荧光信号的强度与扩增的产物的量呈正比，从而实现了对未知样品的定性和定量检测。目前，此技术在检测大肠杆菌O157：H7应用中的报道相对较少。表3总结了分子信标技术在检测大肠杆菌O157：H7时用到的引物和探针。

表 3 分子信标技术在检测大肠杆菌O157:H7时用到的引物和探针Table 3 Primers and probes used for the detection of E. coli O157:H7 with molecular beacon

除了具有灵敏度高和检测速度快以外，分子信标技术与前两种模式相比，其独有的结构决定了采用该技术检测具有更高的特异性。Singh等[20]用分子信标多重荧光定量PCR方法同时检测大肠杆菌O157：H7和单核细胞增生李斯特菌，分别以大肠杆菌O157：H7基因rfbe和单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因为目的基因设计引物，针对42株已知菌株检测表现出很好的特异性，反应体系各组分间未见任何交叉干扰；在脱脂牛奶模拟检测中，细菌经过6h的富集，2株菌灵敏度都达到了1×101CFU/mL。由于可以同时检测2种菌，该方法与普通荧光定量PCR相比，缩短了检测时间。在60个牛奶样品检测中3个样品中含有大肠杆菌O157：H7，这3个样品分别经过8、12、8h的富集培养，分子信标荧光定量PCR法检测到其含有106.7、105.9、106.7CFU/mL的菌体，而平板计数方法检测则为105.7、105.1、105.5CFU/mL。从60个牛奶样品中提取的菌分别经过8h的富集培养后，检测有1个样品中含有单核细胞增生李斯特菌。该样品经过12h富集培养后分子信标荧光定量PCR法显示有107.3CFU/mL的菌体，而平板计数方法则为105.6CFU/mL。2株菌采用分子信标荧光定量PCR法检测的灵敏度明显比平板计数方法高。Fortin等[21]以大肠杆菌O157：H7的rfbe基因为扩增对象结合巢式PCR，检测灵敏度为2×102CFU/mL。在未经加工牛奶样品检测中，经过6h富集培养后，检测限达1CFU/mL。在供试27株参考菌株中，11株肠出血性大肠杆菌O157：H7、4株O157：NM和1株O157：H―用该方法检测都得到很好的阳性结果，其他11种不同血型的大肠杆菌都表现出阴性结果，表明该方法能快速和准确地检测样品中的O157型大肠杆菌。

分子信标结构决定了其具有设计要求高、杂交探针不能完全与模板结合、稳定性较差、探针合成和标记较复杂等缺点。

2.3.2 双杂交探针法

双杂交探针(dual-oligo FRET pairs)又称为FRET或者light cycle探针，它由两条相邻且与模板互补的特异性探针组成，在一条探针的5’端标记供体荧光基团，另一探针的3’端标记受体荧光基团。在退火时，2条探针与靶序列特异性结合，首尾连接，2个荧光基团互相靠近，受体基团吸收或抑制供体基团的发出的荧光；而在自由状态时，两者距离较远，受体基团发出的荧光不能被供体基团吸收或抑制，系统检测到荧光信号，且供体基团荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。目前，还没有文献报道双杂交探针法在大肠杆菌O157：H7检测中的应用。

3 结 语

由大肠杆菌O157：H7引起感染性腹泻，目前还没有一种特效药或有效的治疗手段，因此建立快速、准确的检测方法对大肠杆菌O157：H7的预防显得极为重要。荧光定量PCR技术是近几十年发展起来的新型技术。在进行实际样品的定量检测时，样品不同，含有的PCR反应抑制剂[22]可能不同，常见的抑制剂有：昆虫眼色素、SDS、EDTA、NaCl、二价盐、多糖、尿素、血红素等[23-25]，因此分离细菌这一步骤尤为重要。针对不同的实际样品有不同的分离方法(图1)，模板使用基因组DNA操作简单，而使用mRNA能避免死菌假阳性结果，菌体直接裂解污染小。荧光定量PCR与传统的平板计数方法比较，节约时间和工作量；与常规PCR相比特异性好、灵敏度高、重复性强和自动化程度高，适应食品微生物检验发展需要以及大肠杆菌O157：H7的快速诊断。另外，近年来也有许多科研工作者采取荧光定量PCR结合PMA预处理的方式对大肠杆菌O157：H7等的死菌和活菌数量进行定量分析，该方法的应用能使荧光定量PCR对活菌定量结果在一定程度上更准确和客观[26-29]。目前，荧光定量PCR已经成为生命科学领域研究的主要工具之一，若能配合其他新型试剂或方法则会更大程度地体现其应用价值。

图 1 荧光定量PCR检测食源致病菌的一般流程[20,26,30]Fig.1 Flow chart for the detection of foodborne pathogen with qPCR[20,26,30]

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