利用PCR技术对猪伪狂犬疫苗含毒量的评价

刘中原，刘 石，徐卫松，陈雅君，张莉娟，魏战勇

(1.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002;2.河南农业职业学院，河南 中牟 451450)

猪伪狂犬病 (PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起多种家畜和野生动物的一种急性传染病［1］。感染猪伪狂犬病毒的猪临床症状表现为体温升高，新生仔猪主要表现为神经症状，猪伪狂犬病一年四季均可发生，但以冬春两季和产仔旺季多发，往往在分娩高峰时的母猪舍先发病，而且几乎每窝都发病，发病率可达100%。近一两年来PRV的持续性感染和潜在的免疫抑制，给猪的疾病防治工作带来了很大的困难，并且给我国的养殖业造成了巨大的经济损失。

目前对该病的药物治疗效果不佳，采用疫苗接种是预防该病的主要措施。当前市场上出售的猪伪狂犬疫苗质量参差不齐，对猪群的保护力也千差万别，大部分养殖户对疫苗的含毒量不甚了解就盲目的选用疫苗进行免疫预防，结果导致猪群体抗体水平不高，达不到有效的免疫保护力。2012年初，新郑某猪场发生猪伪狂犬病，起初并没有怀疑疫苗，对健康猪群紧急免疫猪伪狂犬疫苗之后，也没有控制住病情。该场经理就怀疑猪伪狂犬疫苗含毒量低，免疫猪群之后达不到有效的免疫力。鉴于市场出售的猪伪狂犬疫苗含毒量的不同，为给养殖户们选择疫苗提供参考依据，根据普通PCR技术［2-3］，建立起了对猪伪狂犬疫苗含毒量进行鉴定的方法，通过此方法旨在找出含毒量较高的猪伪狂犬疫苗进行免疫预防，从而提高猪群免疫成功率，达到降低经济损失的目的。

1 材料与方法

1.1 疫苗

从市场上购买3种不同厂家生产的猪伪狂犬疫苗，分别标记为1号、2号、3号。其中1号猪伪狂犬疫苗含毒量是20头份，2号猪伪狂犬疫苗含毒量是10头份的，3号猪伪狂犬疫苗含毒量是20头份的。

1.2 引物设计

根据GenBank上公布的猪伪狂犬病毒基因保守序列gh片段上的基因，运用引物设计软件Primer5.0设计一对针对猪伪狂犬病毒的gh片段的引物。

上游引物序列为 5'-GCGTGTACTGCGAC TGCGTGTT-3'，下游引物序列为 5'-CGA CCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3'。扩增片段大小为355 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要试剂以及仪器

DNA Marker DL2000大连宝生物工程有限公司生产;Protein K(美国 Amresco);SIGMA台式高速低温离心机;美国ALPHA INNOTECH紫外凝胶成像仪;PCR仪 (PTC-200型)MJ RESESRCH品牌。瑞兴科技有限公司生产的 SDS消化缓冲液、Tris饱和酚、苯酚/氯仿/异戊醇;琼脂糖购自北京美莱博医学科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯产品。3K30型冷冻离心机 (sigma);微量加样器 (Eppendorf;S2-93自动双重纯水蒸馏器 (上海);DYY-111-6B型电泳仪 (北京六一仪器厂);DYCP-31B型电泳槽 (北京六一仪器厂);凝胶图像分析系统 (Alpha Innotech);UNICO UV-2102可见紫外分光光度计 (Alpha Innotech)。

1.4 疫苗的稀释

将标记过的1号、2号、3号猪用伪狂犬疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份猪伪狂犬疫苗毒。取稀释好的猪伪狂犬1号疫苗1 mL移入高压过的1.5 mL EP管内，在此EP管中取100 μL移入到新EP管内，加入900 μL灭菌生理盐水混匀后即成10倍稀释物，在10倍稀释物的 EP管中取100 μL移入到新 EP管内，加入900 μL灭菌生理盐水混匀后即成100倍稀释物，在100倍稀释物的EP管中取100 μL移入到新 EP管内，加入900 μL灭菌生理盐水混匀后即成1 000倍稀释物。采用同样的方法将2号、3号猪伪狂犬疫苗用生理盐水做10倍、100倍、1 000倍的稀释。

1.5 常规方法提取疫苗病毒DNA

将上述稀释好的猪伪狂犬疫苗采用蛋白酶K的方法提取病毒 DNA。具体方法是，将疫苗样品用离心机8 000 r·min-1离心 3 min。取样品上清400 μL，加入 400 μL 的 SDS消化缓冲液，7 μL 的蛋白K，55℃消化1.5 h。样品消化完全之后加入350 μL的Tris饱和酚，然后用离心机8 000 r·min-1离心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的EP管内，加入比例为 25∶24∶1的酚-氯仿-异戊醇 350 μL，然后用离心机8 000 r·min-1离心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的 EP管内，加入氯仿-异戊醇350 μL，8 000 r·min-1离心 3 min。用移液枪吸取离心好的上清移入到新的 EP管内，加入氯仿350 μL，再8 000 r·min-1离心 3 min。吸取离心好的上清加入新的EP管内，再加入等体积的异丙醇，放入-20℃冰箱内沉淀40 min。异丙醇沉淀40 min之后，放入离心机内8 000 r·min-1离心3 min，弃去上清。再加入70%的乙醇350 μL放入离心机内8 000 r·min-1离心3 min洗去其他杂质，重复洗涤1次，弃去上清之后，再放入离心机内8 000 r·min-1离心1 min。取出样品，放在 EP管架上，自然干燥30 min之后加入20 μL的三蒸水洗脱DNA。可以直接当做模版PCR反应，也可以放在-20℃冰箱内保存备用。

1.6 PCR扩增

采用的PCR反应体系是25 μL反应体系，体系组份如下:每一个反应管中加2倍PCR Taq Mix 8 μL(组 成 为 400 μmol dNTP each;0.2 U Taq DNA Poly-merase·μL-1;100 mmol KCl;20 mmol Tris-HCl;3 mmol MgCl2);猪伪狂犬病毒gh基因上、下游引物 (引物浓度为20 pmol·μL-1)每一个反应管中分别为1 μL，提取的DNA作为PCR反应体系中的模板，每一个反应管中加2 μL，最后每一个反应管中补加高压过的双蒸水13 μL。按照优化过后的猪伪狂犬病毒gh基因片段的程序进行扩增:95℃变性10 min，94℃ 45 S，退火温度54℃ 30 S，72℃ 1 min，共30个循环，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。PCR程序反应结束之后，取5 μL PCR扩增得到的产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外凝胶成像仪照相，记录实验结果。

2 结果和分析

2.1 对猪伪狂犬疫苗毒稀释倍数的优化

参考一些 PCR检测［4-6］的方法，将样品进行1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32 和 1∶102 4的倍比稀释进行PCR扩增，琼脂糖电泳结果显示几种稀释倍数之间的扩增结果差异不显著，而且耗时、费力。经过稀释倍数条件优化得到 1∶10倍、1∶100倍、1∶1 000倍的稀释能达到较好的试验结果，并且节省了大量的时间和金钱。

2.2 对PCR反应体系的优化

对PCR反应体系进行了优化，结果2倍PCR Taq Mix 8 μL;上、下游引物 1 μL;模版 2 μL;ddH2O 13 μL;PCR扩增程序优化为 95℃变性10 min，94℃ 45 S，退火温度54℃ 30 S，72℃1 min，共30个循环，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。

2.3 对猪伪狂犬病毒疫苗PCR扩增电泳的检测

对每一种猪伪狂犬病毒疫苗稀释为4管，提取DNA进行PCR扩增之后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。1号猪伪狂犬疫苗10倍稀释之后电泳条带就不太亮了，100倍稀释之后就没有电泳条带了，说明1号猪伪狂犬疫苗的抗原含量低，若用于临床上猪群的免疫预防很可能起不到良好的免疫保护力。而从市场购买的2号猪伪狂犬疫苗在稀释1 000倍之后还能够隐约看到电泳条带，说明其抗原含量高，若采用抗体效价的表示方法来计算其含毒量的话，疫苗含毒量高达210可以应用于猪群的免疫预防。同样的道理，3号猪伪狂犬疫苗含毒量约27，免疫猪群之后也能产生较好的免疫力。

图1 1-3号猪伪狂犬疫苗PCR扩增结果

3 小结和讨论

从2011年至今猪伪狂犬病在我国部分地区接连不断的发生，给我国养殖业造成了重大的经济损失。有些养殖户开始怀疑市场上出售的猪伪狂犬疫苗抗原效价不高，达不到理想的免疫保护力，他们急需知道自己所使用的猪伪狂犬疫苗质量的好坏。有报道［7］称，进口的猪伪狂犬疫苗引发了伪狂犬病的流行，那么我国当前市场的猪伪狂犬疫苗含毒量能不能有效的保护猪群的健康，不仅是每一个养殖户想知道的，对于我们科研工作者也是想迫切知道的。陈伟杰等［8］比较了三种 ELISA试剂盒对猪伪狂犬病gE抗体的检测效果，罗飞等［9］建立了血清中猪伪狂犬gB抗体的ELISA检测方法，由此可见利用ELISA技术检测抗体效价的技术比较成熟。而利用ELISA技术检测猪伪狂犬病毒抗原的报道很少，从疫苗中检测抗原的含量来评价疫苗的相关文献在国内就更少见了。

本试验根据抗体效价检测的一般原理，采用疫苗抗原倍比稀释的方法对市场上出售的猪伪狂犬疫苗进行PCR检测，使抗原检测与PCR技术得到了完美的结合，得到了较好的实验结果，能够为临床上选用猪伪狂犬疫苗提供参考。也可以采用此方法对市场上出售的其他疫苗进行含毒量的检测，为临床的使用提供参考依据。

笔者建立的利用PCR技术检测疫苗抗原的方法，能够省去繁重的劳动强度、节省大量的时间和经济成本，为疫苗抗原检测提供了一条新的思路。

［1］ 殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京:科学出版社，1997:998-1009.

［2］ 赵丽，崔保安，方忠意，等.PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的研究应用 ［J］.中国预防兽医学报，2007，29(2):143-145.

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［7］ 芦惟本，黄川.进出口伪狂犬弱毒疫苗引发伪狂犬病流行的报道 ［J］.今日养猪业，2009(4):15-16.

［8］ 陈伟杰，赵灵燕，周彩琴，等.3中ELISA试剂盒检测猪伪狂犬病 gE抗体的比较 ［J］.畜牧兽医，2009，41(11):57-59.

［9］ 罗飞，李宇琴，陈义平，等.猪伪狂犬病血清抗体 gBELISA检测方法的建立 ［J］.中国兽药杂志，2011，45(7):10-13.