分离自藏灵菇的乳酸菌的益生特性*

郭志华，杨洪

(宿州学院化学与生命科学学院，安徽 宿州，234000)

藏灵菇是源自西藏藏南的林芝地区和新疆天山天池以上海拔山区的特有珍稀菌种，呈乳白色、胶质状，外形酷似米粒;经过牛奶培养，个体会慢慢增大，形状如盛开的雪莲，故又称之为西藏雪莲。藏灵菇发酵奶的风味与普通酸奶有较大的差别，除了具有发酵奶特有的酸味、香味，还有轻微的醇香味［1］。

藏灵菇的发酵液营养丰富，具有医疗和保健作用。经过研究发现藏灵菇发酵液具有提高人体免疫［2］、调节肠胃［3-4］、抑菌［5］、抗氧化［6-7］等功能;并证实藏灵菇主要由乳酸菌和酵母菌组成［8-9］。其中乳酸菌是一种安全、优质的益生菌，在人体内具有抑制病原菌生物生长、维持肠道菌群平衡、调节胃肠功能等益生作用。

本研究主要从藏灵菇中分离纯化乳酸菌，研究乳酸菌的益生特性，为食品发酵生产提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

藏灵菇来自于民间。在实验室将藏灵菇放在10%(W/V)的无菌脱脂牛奶(105℃灭菌20 min)中，置于28℃环境，每隔2 d更换一次牛奶。

1.1.2 培养基

MRS培养基:1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.2%柠檬酸氢二铵，2%葡萄糖，0.1%吐温80，0.5% 乙酸钠，0.2%K2HPO4，0.058%MgSO4，0.025%MnSO4，1.8%琼脂，蒸馏水 100 mL，pH 6.2 ～6.6。

1.1.2 试剂

PCR试剂盒、胶回收试剂盒等购于Invitrogen公司;药敏试纸购于北京天坛生物技术开发公司;其余均为国产分析纯或化学纯。

1.1.3 仪器

AL204分析天平;BBS-SDC-A超净工作台;MULTISKAN GO酶标仪，美国Thermo;SHP-250型生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

用接种环取1环藏灵菇发酵乳培养物，在含有1%CaCO3的MRS平板上划线，37℃培养48 h，灭菌牙签蘸取有透明圈的单菌落，接入MRS液体培养基中37℃培养48 h，进行接触酶反应。

1.2.1 乳酸菌的鉴定

1.2.1.1 形态特征观察

观察单菌落形状、颜色、表面等培养特征。进行革兰氏染色，显微镜观察菌体形状、排列方式等形态特征。

1.2.1.2 16S rDNA的扩增和序列分析

基因组DNA的提取参照文献［10］的方法并稍做改进。以细菌16S rDNA通用引物为上下游引物，染色体DNA为模板扩增菌株的16S rDNA。PCR反应条件为:94℃ 3 min;94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 2 min，循环29次;72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由生物技术有限公司测序，16SrDNA序列通过Blast进行核酸数据比较。1.2.2 乳酸菌益生特性研究

1.2.2.1 产酸实验

将分离菌株接种MRS液体培养基(pH 6.4)，置于37℃培养24 h，用pH计测定培养基的pH的变化，同时测滴定酸度。

1.2.2.2 pH对菌株生长的影响

将MRS液体培养基 pH值调为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，分别取各pH的培养基5 mL置于试管中，灭菌备用。将分离的菌株接种于MRS液体培养基中培养24h后，取新鲜菌液按5%(v/v)分别接种于上述各pH的试管中，置于37℃培养24 h后测OD600。

1.2.2.3 温度对菌株生长的影响

分离出的乳酸菌接种MRS液体培养基中，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃水浴 1h，按 5%(v/v)接种于新鲜液体培养基，置于37℃培养24 h，测OD600。

1.2.2.4 耐胆盐能力测定

用猪胆盐配制含有0.1%、0.2% 、0.3%、0.4%、0.5% 和0.6%胆盐浓度的MRS液体培养基，将制备好的菌悬液按5%(v/v)接种到各培养基中，37℃恒温培养48 h，测OD600。

1.2.2.5 菌株对肠道有害菌群的抑菌性试验

将活化好的金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(S.enterica)菌液稀释，取0.1 mL涂布在固体培养基中。将滤纸制成直径为6 mm的圆形纸片(121℃灭菌30 min)，收集乳酸菌发酵液，将浸染发酵液的纸片分别贴于涂有致病菌的平板上，每个平板贴3个滤纸片，两两相距30 mm左右，37℃培养48 h，观察并测量抑菌圈直径大小。

1.2.2.6 抗药性实验

利用药物纸片琼脂扩散法，抗生素浓度分别为:乙酰螺旋霉素2 240 U/mL;青霉素2 000 U/mL;链霉素2 000 μg/mL，将益生菌涂布在MRS琼脂培养基上后，将浸染抗生素的药片贴于平板上，于37℃培养48 h，观察并测量抑菌圈直径大小。

所有的实验数据采用excel软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的鉴定

2.1.1 形态观察与培养特征测定

采用含CaCO3的MRS培养基分离纯化出5株乳酸菌，这5株菌革兰氏染色均为阳性，接触酶反应为阴性，初步判断符合乳酸菌特征。显微镜观察，zlg1、zlg3、zlg4均为球菌，球形或卵圆形，无芽孢，成对或短链状;zlg2、zlg5均为杆菌，无芽孢，单个或短链状。

2.1.2 16S rDNA的扩增和序列分析

以菌株的DNA为模板，PCR扩增得到大小为1.5 kb的基因片段。采用Blast与GenBank中已登录的基因序列进行比对，结果发现zlg1、zlg3、zlg4的16S rDNA与乳酸乳球菌的同源性分别为98%、98%、99%;zlg2、zlg5的16S rDNA与嗜酸乳杆菌的同源性分别为98%、98%。

根据培养特征和16S rDNA比对分析。zlg1、zlg3、zlg4初步鉴定为为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);zlg2、zlg5初步鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactcbacillus acidophilus)。取zlg4和zlg2为实验对象，研究其益生特性。

2.2 zlg4和zlg2益生特性研究

2.2.1 产酸试验

牛乳发酵过程中，乳糖水解产生乳酸，使牛乳的pH值下降滴定酸度上升。酸度是发酵乳的重要指标之一，与产品的口味、质地和风味有关。图1表明，zlg2、zlg4在发酵前4 h，菌株生长缓慢，产酸能力较弱，组间组内显著差异性显著(P＞0.05)。从4 h到20 h，随着发酵时间延长，乳酸菌开始大量繁殖，产酸量大幅增加，pH值快速降低，zlg2的产酸量要大于zlg4，组间组内显著差异(P＜0.05)。20 h后菌体生长开始逐渐衰亡，pH值降幅趋缓。

图1 乳酸菌发酵过程中pH值和滴定酸度的变化Fig.1 Change in pH value and titratable acidity of lactic acid bacteria during fermentation

2.2.2 pH值对菌株生长的影响

由图2可知，当pH值为2、3时，两菌株生长较缓慢;pH值为4时有一定程度的生长;在pH值为5时能够较好地生长;pH值为6时生长最好。说明这2株菌有较好的耐酸性。

2.2.3 温度对菌株生长的影响

图2 pH对菌株生长的影响Fig.2 Effect of pH on growth of lactic acid bacteria

由图3可看出，2株菌经30℃、40℃水浴处理后生存率最高，组内组间差异不显著(P＞0.05);50℃水浴处理后的存活率与40℃相比，zlg4和zlg2分别为:88%、71.43%;60℃水浴处理后，zlg4存活率为65%，zlg2为43%。经统计分析，50℃、60℃水浴处理后2株菌存活率存在显著差异(P＜0.05)，zlg4的温度耐受性大于zlg2。

图3 温度对菌株生长的影响Fig.3 Effect of temperature on growth of lactic acid bacteria

2.2.4 耐胆盐能力测定

由图4可看出，低浓度胆盐(0.1%)对2株菌的生长没有明显影响，组间组内无显著差异(P＞0.05);随着胆盐浓度的升高，2菌株的存活率逐渐下降，当胆盐浓度为0.4%和0.5%时，2株菌的存活率降至39%和29%。且从胆盐浓度为0.2%开始，2株菌之间的存活率存在显著差异(P＜0.05)，说明这2株菌对胆盐耐受力不同，zlg2要强于zlg4。

图4 乳酸菌耐胆盐性Fig.4 Bile toleranc of lactic acid bactera

2.2.5 2菌株对肠道有害菌群的抑菌性试验

表1说明2株乳酸菌对3种肠道病菌均有一定抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌抑制效果较明显。zlg2的抑菌性强与zlg4，统计分析结果显示存在显著差异(P＜0.05)。由产酸试验可知，zlg2产酸性强于zlg4，酸性较强可导致周围环境pH值下降，降低氧化还原电位，对许多革兰氏阳性或阴性细菌产生抑制作用［11］。此外，乳酸乳球菌可普遍产生乳酸乳球菌素，对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用［12］。

表1 乳酸菌抑菌圈直径 mmTable 1 The bacteriostasia diametere of lactic acid bacteria mm

2.2.6 耐药性试验

由图5可看出2株菌对青霉素、氨苄青霉素、氯霉素较敏感;对庆大霉素、氟哌酸敏感不强。统计分析表明，2株菌的耐药性存在显著差异(P＜0.05)。

图5 乳酸菌耐药性Fig.5 Resistance to antibiotic resistance of lactic acid bacteria

3 讨论

从藏灵菇中筛选出5株乳酸菌，通过形态特征、16SrDNA序列同源性分析，初步鉴定3株菌为乳酸乳球菌，2株菌为嗜酸乳杆菌。

益生菌在到达肠道前先要通过胃，胃中的胃酸可以杀死大部分微生物，开发益生菌首先要考察其对酸的耐受能力。zlg2和zlg4在pH值为2、3时生长较缓慢，pH值为4时可生长。

温度是影响菌株发酵的重要因素之一，高温可缩短凝乳时间，2株菌经50℃、60℃水浴处理后仍有一定的存活率，说明两株菌可耐受高温。耐胆盐也是乳酸菌特性之一，2株菌在胆盐浓度为0.4%和0.5%时，仍有39%和29%的存活率。乳酸菌可产生有机酸、细菌素等抑菌物质，可杀死肠道有害菌群，具有维持肠道菌群平衡功能。

本研究中发现2株菌对常见抗生素如青霉素、氨苄青霉素、氯霉素较敏感，但对庆大霉素和氟哌酸产生耐药性。FAO/WHO在《用于食品益生菌安全性评价指导原则》中指出，益生菌存在的可能危害包括益生菌菌株产生广泛的耐药性，可以使抗药基因在菌株之间传播［13］。乳酸菌抗药性有内源抗药性和获得性抗药性，内源性抗药性一般不发生抗药基因的水平转移;获得性抗药性表现出高水平的抗药性，抗药基因可在细菌种属间传播［14］。目前应用到发酵食品中的乳酸菌基本都是野生型，一般不经过二次消毒即可直接食用，有可能与肠道正常菌群或致病菌进行抗药因子的传递。乳酸菌在作为生产菌株之前，有必要检测菌株耐药性，预防抗药菌株的扩散。

［1］ 甘伯中，杜宁娟，李帆，等.藏灵菇及其优势菌群的发酵性能研究［J］.食品与发酵工业，2008，34(9):105-108.

［2］ 薄芯，李京霞.西藏灵菇发酵奶对小鼠免疫功能的影响初探［J］.中国乳品工业，2011，39(6):19-21.

［3］ 薄芯，李京霞.西藏灵菇发酵奶对小鼠消化系统的保健作用探索［J］.中国乳品工业，2010，38(7):29-31.

［4］ 李丽秋，王春敏.宋淑贤，等.西藏灵菇奶对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的调整作用［J］.中国微生态学杂志，2004，16(4):197-198.

［5］ 孙卓，吕加平，冯铄涵，等.藏灵菇菌发酵性能以及抑菌特性研究［J］.中国酿造，2011，21(4):147-150.

［6］ 刘慧，王世平，冉冉.藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对大鼠脂质过氧化的影响［J］.中国食品学报，2010，10(3):27-30.

［7］ 刘慧，王世平，冉冉.藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对大鼠肝脏胆固醇的作用［J］.中国食品学报，2010，10(2):35-39.

［8］ 刘宇峰，王金英，曲晓军.西藏灵菇菌的菌相菌学的研究［J］.中国乳品工业，2005，33(9):35-39.

［9］ 周剑忠，董明盛，江汉湖.PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌［J］.中国农业科学，2006，39(8):1 632-1 638.

［10］ 颜子颖，王海林，译.精编分子生物学实验指南［M］.北京:科学出版社，1999.

［11］ 郭本恒.益生菌［M］.北京:化学工业出版社，2004:441-442.

［12］ 初晓东，林宇恒，孙志增，等.乳链菌肽(nisin)抗性机制的研究进展［J］.微生物学报，2010，50(9):1 129-1 134.

［13］ Wassenaar T，Klein G.Safety aspects and inplications of regulation of probiotic bacteria in food and food supplements［J］.J Food Prot，2008，71(8):1 734-1 741.

［14］ 孔健，季明杰，杨埔.食源性乳酸菌抗药性分析［J］.山东大学学报(理学版)，2011，46(10):178-182.