超声醇溶-紫外分光光度法测定不同产地三七花中总黄酮含量*

朱艳琴，殷勤红，杨俊，杨朝芬，孙晓东

1(昆明理工大学分析测试研究中心，云南昆明，650093)

2(昆明积大制药股份有限公司，云南昆明，650106)

三七花是传统名贵中药五加科植物三七的干燥花蕾(flower buds of Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)，盛产于云南文山、广西等地，含有各种人参皂苷［1］、三七花苷元［2］等，作为药材已载入《云南中草药选》，“甘凉，清热平肝，降压，治疗高血压，头昏，目眩，耳鸣，急性咽喉炎”。三七花既是名贵中药药品，又是优等食品、保健品，可泡茶、炒肉、煲汤等药膳食疗，长期服用对治病和养生都颇有裨益［3-10］。但目前相关的研究力度尚为薄弱［11-13］。本实验采用超声醇溶-紫外分光光度法对不同产地的12批三七花总黄酮含量进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三七花，2009年8月采于云南省各地州，经云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室虞泓教授鉴定为五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)的干燥花蕾。无水乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3(中国医药集团上海化学试剂公司，AR级);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-200306)。

UV-2550型紫外可见分光光度计(SHIMADZU制作所)，SB3200型超声波清洗器(必能信超声有限公司);BP211D电子天平(Sartorius公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准溶液配制

精确称取经60℃减压干燥至恒重的芦丁标准对照品30.7 mg，加60%乙醇溶解并定容至50 mL，制成浓度为0.614 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 待测样品的提取

取本品粉末0.2 g，加60%乙醇溶液5 mL，超声1 h，混匀，5 000转 r/min离心5 min，重复3次。吸取上清液2 mL至25 mL量瓶中，用60%乙醇溶液定容。用分光光度计在508 nm波长处测定吸光度，以60%乙醇代替样品溶液，作为空白溶液。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

称取编号为S12的三七花粉末0.2 g，分别加浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 乙醇溶液5 mL，照1.2.2项下方法操作，考察不同乙醇浓度对总黄酮含量的影响，结果见图1。

图1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavones

随着乙醇浓度的增加，三七花总黄酮含量也升高，但乙醇浓度为60%时，总黄酮含量为最大;随着乙醇浓度的进一步增加，三七花总黄酮含量却降低。因此提取液选择乙醇浓度为60%。

2.1.2 料液比对总黄酮含量的影响

称取编号为S12的三七花粉末0.2 g，分别加60%乙醇溶液 2、3、4、5、6、7、8 mL，照 1.2.2 项下方法操作，考察不同料液比对总黄酮含量的影响，结果见图2。由图2可知，当料液比为1∶25时，三七花总黄酮含量为最大，随着料液比的进一步增加，总黄酮增加不明显。因此选择料液比为1∶25。

图2 料液比对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the yield of total flavones

2.1.3 超声时间对总黄酮含量的影响

称取编号为S12的三七花粉末0.2 g，加60%乙醇溶液 5 mL，分别超声 20、40、60、80、100、120 min，照1.2.2方法操作，结果见图2。超声时间为60 min时，总黄酮含量为最大;随着超声时间的进一步增加，三七花总黄酮含量增加不明显。因此提取液选择超声时间为60 min。

图3 超声时间对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of total flavones

2.2 标准曲线的绘制

取上述对照品溶液各 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL芦丁对照品溶液，分别置于20 mL试管中，加甲醇至2 mL，再加50 g/L亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min;再加入100 g/L硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min;再加入40 g/L氢氧化钠溶液10 mL，再加入60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min后，以蒸馏水为空白溶液，在508 nm波长处测定各标准品溶液的吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，并求出回归方程为:Y=13.825X-0.007 4，R2=0.999 4。样品测定见图4。

图4 总黄酮标准曲线图Fig.4 Standard curves of total flavones

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取编号为S12的样品溶液，分别在508 nm波长处测定吸光度，分别为 0.255，0.256，0.257，0.255，0.258，0.257，平均值为 0.256，RSD 为 0.47%(n=6)，表明试验的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取编号为S12的待测样品，分别放置于室温，于0、10、20、30、40、50、60 min 时测定吸光度，分别为0.257、0.254、0.251、0.246、0.245、0.242、0.241，平均值为0.248，RSD为2.46%(n=7)，表明待测样品在1 h内较稳定。

2.3.3 重复性试验

取编号为S12的样品，按照1.2.2项下的方法操作，平行制备6份样品，分别在508 nm波长处测定吸光度，含量分别为 0.472%，0.476%，0.482%，0.485%，0.476%，0.478%，平均值为 0.478%，RSD为0.98%(n=6)，表明试验的重复性良好。

2.3.4 加样回收率试验

取已知含量的三七花(编号S12)粉末各6份，每份约0.1 g，分别加入上述芦丁对照品溶液各1 mL，按1.2.2项下的方法平行制备样品溶液，测定吸光度，结果见表1。

表1 加样回收率试验表Table 1 Recovery of adding standards

2.4 三七花总黄酮含量的测定

取下表中12个不同产地的三七花样品，按1.2.2项下的方法平行制备样品溶液，测定吸光度，计算其含量，结果见表2。

表2 三七花中总黄酮含量测定结果Table 2 Assay results of flavones in Panax notoginseng flowers

3 讨论与结论

本研究采用超声醇溶的方式提取三七花中的黄酮类化合物，并对总黄酮含量进行了测定。从研究结果看，云南马关县八寨镇和文山县开化镇东山乡的三七花总黄酮含量最高，达到了0.73%和0.72%;而云南砚山县江娜镇铳卡村和空心山的三七花总黄酮含量最低，仅有0.43%和0.45%。表明云南产三七花总黄酮含量差异较大，这可能与三七花的产地、种植条件、采收期等有关。三七花因含特有的甘味而受到众多消费者的喜爱，随着研究的逐步深人，必然会为新药研发提供更坚实的理论基础，同时也为三七花的可持续产业化发展道路指明了方向。

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