胃癌中幽门螺杆菌L型感染和淋巴管生成因子与淋巴结转移的关系＊

蔡兆根， 于东红， 吴海波， 冯振中， 赵 艳

1蚌埠医学院第一附属医院临床病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠233003

2安徽医科大学附属省立医院临床病理科，合肥230001

国内外有关幽门螺旋菌（helicobactor pylori，Hp）感染与胃癌的关系已成定论，而Hp－L型感染与胃癌关系的研究较少，Hp－L型与胃癌的淋巴管转移之间的关系鲜见报道［1－2］。肿瘤淋巴管新生与实体瘤的发生、发展关系密切［3－5］。VEGF家族是目前公认的主要淋巴管生成因子家族，通过与淋巴管内皮细胞上的VEGFR－3受体结合，引发多信号通路级联反应，促使淋巴管内皮细胞增殖、分化和迁移，从而形成新生的毛细淋巴管［6］。D2－40抗体是新发现的特异性淋巴管标志物，目前广泛地用于标记实体肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞。微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LVD）是反映肿瘤淋巴管生成的有效指标。本实验通过检测胃癌组织中的Hp－L型感染情况、血管内皮生长因子VEGF－C、－D、－A和成纤维细胞生长因子－2（FGF－2）的表达情况及LVD值，旨在探讨胃癌组织中Hp－L型感染及淋巴管生成因子与淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1．1 标本

收集2008年6月至2009年6月间，蚌埠医学院第一附属医院病理科存档的112例胃癌手术切除标本的石蜡组织块及相关临床病例资料，随机抽取胃癌手术标本切缘组织30例作为正常对照。所有苏木精－伊红染色切片均经组织学复查确认。患者术前未进行任何放化疗、生物学治疗及抗生素治疗。其中男93例，女19例；年龄36～81岁，中位年龄为54岁。淋巴结转移者68例，无转移者44例。

1．2 试剂和方法

所有蜡块均分别切片编号，厚4μm，行常规苏木精－伊红染色、革兰染色和免疫组化染色SP法。用已知阳性的组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，具体操作按试剂盒说明书进行；组织切片革兰染色按常规染色进行。鼠抗人D2－40单克隆抗体（克隆号：D2－40）购自福州迈新公司；兔抗人 VEGF－C多克隆抗体（产品编号：ZA－0266）购自北京中杉金桥生物公司；兔抗人VEGF－D单克隆抗体（克隆号：MM0007－7E79）、兔抗人 VEGF－A 多克隆抗体（产品编号：SC－152）和兔抗人FGF－2单克隆抗体（克隆号：N－19）均购自美国 Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人Hp－L型抗体由蚌埠医学院微生物学教研室制备［7］。

1．3 结果判断

1．3．1 幽门螺杆菌L型的检测及结果判定 Hp－L型大多数呈革兰染色阴性，少数Hp－L型革兰染色阳性。Hp－L型形态多样，大小不等，大多数呈圆球形。在油镜（10×100）下观察并计数；每例随机观察8～10个不同视野，取平均数，L型菌数≥20个定为阳性，＜20个为阴性。Hp－L型抗体免疫组化的阳性标准为：胃癌细胞、正常胃黏膜上皮细胞及间质巨噬细胞的胞质或胞膜着棕黄色细颗粒为阳性。革兰染色和免疫组化染色两者同时阳性定为Hp－L型感染阳性。

1．3．2 免疫组化染色结果判定和淋巴管密度（LVD）计 算 VEGF－C、VEGF－D、VEGF－A 和FGF－2在胃癌细胞中的表达定位于细胞质，阳性染色为黄色或棕黄色颗粒。采用双盲法，根据染色程度和染色细胞百分率进行综合评分：不着色为0分，着淡黄色为1分，着棕黄色为2分，着棕褐色为3分；着色细胞数占计数细胞总数的百分比＜5%为0分，5%～为1分，25%～为2分，50%～为3分，75%～为4分。每张切片的平均着色强度得分与平均着色细胞百分率得分相乘为其最后得分：0分为阴性（－）；1～4分为弱阳性（＋）；5～8分为中度阳性（⧺）；9～12分为强阳性（⧻）。

D2－40表达阳性为淋巴管内皮细胞着棕黄色或者棕褐色。淋巴管密度计算参照文献［8］：先于低倍视野下确定3个胃癌及其周围组织淋巴管密集区域（热点），然后在40×10倍放大视野下观察和计数着色的管腔或细胞簇，取3个区域高倍视野下淋巴管平均数作为肿瘤新生淋巴管密度值。

1．4 统计学分析

2 结果

2．1 Hp－L型的分布特点及检测结果

观察革兰染色切片发现，Hp－L型大部分是革兰染色阴性，多数为圆球形，可在癌巢、癌间质或粘膜层聚集成堆，也可散在分布于其中，癌巢的坏死处几乎无Hp－L型，正常组织内较少见。L型阳性的组织切片上均可见到L型粘附于癌细胞及黏膜细胞表面的现象。112例胃癌中有73例革兰染色细菌阳性，阳性率为65%；免疫组化Hp－L型抗原表达阳性69例，阳性率为62%，与革兰染色L型检出阳性率具有一致性（P＞0．05），两组同时阳性的病例有68例，阳性率为61%，明显高于对照组的28%（P＜0．01）。见图1、2。

图1 Hp－L型在胃癌组织内主要呈圆球形（革兰染色，×1 000）Fig．1 Massive spherical Hp－L in gastric carcinoma（Gram staining，×1 000）

图2 Hp－L型在胃癌组织内的表达（SP，×400）Fig．2 Hp－L expressed in gastric carcinoma（SP，×400）

2．2 胃癌组织中D2－40标记的LVD值

D2－40标记阳性的微淋巴管管壁薄，无肌层，形态欠规则，腔内无红细胞。微淋巴管数目在胃癌癌周组织中较多且多为开放的管腔；而在胃癌组织中心区微淋巴管数量稀少且多为细小腔隙或条形闭锁状，仅有个别开放的管腔；对照组微淋巴管分布稀疏且主要位于黏膜下层和外膜层，为组织本身所固有的淋巴管。

因新生淋巴管主要位于癌组织周边区，癌中心区相对较少，故以癌周区的淋巴管数为主计算LVD，结果显示，112例癌周组织中D2－40标记阳性的LVD值为（14．61±2．24）；与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0．01）。有淋巴结转移组LVD值高于无淋巴结转移组。见图3～5。

2．3 VEGF－C、－D、－A及FGF－2蛋白的表达与 Hp－L型之间的关系

VEGF－C、－D、－A 及 FGF－2主要表达于癌细胞的胞质中，在间质纤维细胞、炎细胞及脉管内皮细胞中亦有少量表达。在胃癌组织中阳性表达率分别为66%、56%、48%和42%，明显高于对照组（均P＜0．01）。Hp－L型阳性组VEGF－C、－D表达阳性率高于Hp－L型阴性组，差异具有统计学意义（均P＜0．01），而 VEGF－A及FGF－2的表达与 Hp－L型未见确切相关性。见表1，图6～9。

图3 D2－40在胃癌癌旁间质淋巴管的表达（SP，×400）Fig．3 Expression of D2－40protein in peritumoral lymphatic vessels in gastric cancer（SP，×400）

图4 D2－40在正常组织间质淋巴管的表达（SP，×400）Fig．4 Expression of D2－40in lymphatic vessels in normal gastric tissues（SP，×400）

图5 D2－40在胃癌组织内淋巴管的表达（SP，×400）Fig．5 Expression of D2－40in lymphatic vessels in intratumoral tissues of gastric cancer（SP，×400）

表1 胃癌组织中 VEGF－C、－D、－A、FGF－2的表达与 Hp－L型之间的关系Table 1 Correlation between the HP－L infection and the expression of VEGF－C，－D，－A，and FGF－2

图6 VEGF－C在胃癌内的表达（SP，×400）Fig．6 VEGF－C protein expressed in gastric carcinoma（SP，×400）

图7 VEGF－D在胃癌内的表达（SP，×400）Fig．7 VEGF－D protein expressed in gastric carcinoma（SP，×400）

图8 VEGF－A在胃癌内的表达（SP，×400）Fig．8 VEGF－A protein expressed in gastric carcinoma（SP，×400）

图9 FGF－2在胃癌内的表达（SP，×100）Fig．9 FGF－2protein expressed in gastric carcinoma（SP，×100）

2．4 VEGF－C、－D、－A、FGF－2及Hp－L型和LVD值之间的关系

Hp－L型阳性组和VEGF－C、－D阳性组的LVD值均高于阴性组，差异具有统计学意义（均P＜0．01）；而 VEGF－A 及 FGF－2阳性组的 LVD 值与阴性组LVD值之间的差异无统计学意义。见表2。

2．5 Hp－L型、LVD值和 VEGF－C、－D、－A及FGF－2与胃癌临床病理因素的关系

经统计学分析发现，Hp－L型感染与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期具有相关性；LVD值与淋巴结转移、TNM分期相关；同时，VEGF－C、－D的表达与淋巴结转移、TNM分期相关，而VEGFA及FGF－2的表达与临床病理参数之间未见明显相关性。见表3。

2．6 胃癌淋巴结转移的多因素Logistic回归分析

经多因素Logistic回归分析发现，LVD值和TNM分期与胃癌淋巴结转移明显相关，VEGF－C、－D、－A、FGF－2及 Hp－L感染与胃癌淋巴结转移未见确切相关性。见表4。

3 讨论

肿瘤淋巴管新生在实体瘤的发生、发展和转移过程中起重要作用。VEGF家族中的VEGF－C和VEGF－D是目前公认的主要淋巴管生成因子，两者具有一定的同源性，都可以与淋巴管内皮细胞上的VEGFR－3受体结合，使其迅速活化，并引起下游相应分子的活化，通过MAPK和Akt等信号通路促使淋巴管内皮细胞增殖、分化和迁移，从而形成新生的 毛 细 淋 巴 管［9］。 相 关 研 究 证 实 VEGF－C 和VEGF－D在胃癌组织中的过度表达是淋巴管生成的基础，可诱导肿瘤淋巴管生成，并通过增多的淋巴管促使肿瘤细胞淋巴管转移［10－12］。

表2 胃癌组织中LVD值与 VEGF－C、－D、－A、FGF－2、Hp－L之间的关系（±s）Table 2 Relathionships among the LVD，the expression of VEGF－C，－D，－A and FGF－2，and the Hp－L infection in gastric carcinoma（±s）

表2 胃癌组织中LVD值与 VEGF－C、－D、－A、FGF－2、Hp－L之间的关系（±s）Table 2 Relathionships among the LVD，the expression of VEGF－C，－D，－A and FGF－2，and the Hp－L infection in gastric carcinoma（±s）

与阳性组LVD值比较，＊P＜0．01

因素 阳性组LVD值 阴性组LVD值VEGF－C 15．65±1．96 14．07±2．23＊VEGF－D 15．52±2．06 13．89±2．17＊VEGF－A 14．74±2．40 14．53±2．15 FGF－2 14．35±2．19 14．83±2．31 Hp－L 15．60±1．97 13．96±2．22＊

表3 胃癌组织中 VEGF－C、－D、－A、FGF－2、Hp－L和 LVD值与临床病理因素的关系Table 3 Relationships among the expression of VEGF－C，－D，－A，and FGF－2，Hp－L infection，LVD and clinicopathological factors in gastric carcinoma

表4 胃癌组织中与淋巴结转移相关因素的Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of factors related to lymph node metastasis in gastric carcinoma tissues

本研究结果显示胃癌癌旁正常组织仅见少数VEGF－C、－D表达，且呈局灶性弱阳性，而胃癌组织中 VEGF－C、－D表达阳性率较高，表明 VEGF－C、－D在正常组织中处于封闭或者失活状态，胃癌组织内癌细胞可分泌VEGF－C、－D使之表达升高，通过自分泌或旁分泌的方式诱导肿瘤组织内的淋巴管生成，促进肿瘤细胞的淋巴管侵犯和转移，故提示VEGF－C、－D与胃癌的发生、发展密切相关。

VEGF－A的表达也可以促进肿瘤周围淋巴管的生成，增加淋巴结转移［13］。VEGF－A不仅可以通过直接与VEGFR－2相互作用促进淋巴管的生成，还可以通过招募表达VEGFR－1的炎症细胞包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，从而产生VEGF－C和VEGF－D，间接诱导淋巴管生成。FGF－2是一种多效能的细胞生长因子，以自分泌或旁分泌的方式参与细胞内信号传导，在胚胎发育、血管生成及肿瘤生长等方面具有一定的作用。可以通过与VEGFA类似的途径间接诱导淋巴管的生成，或者通过与其受体FGFR结合直接诱导淋巴管生成［14］。Shin等［15］研究发现，FGF－2具有促血管及淋巴管生成作用，在较低剂量下，主要促进淋巴管的形成，FGF－2信号通路能调节淋巴管内皮细胞的迁移、增殖和凋亡。本实验结果显示，VEGF－A和FGF－2在胃癌组织中的表达高于对照组，但统计学的结果未显示两者与临床病理因素的相关性。这一结果与王晓蕾等［11］研究结果较一致，具体的原因还有待于进一步研究。

D2－40是一种新型的能特异性标记肿瘤组织中淋巴管内皮细胞的单克隆抗体［16］。已有研究证明，许多肿瘤组织中均有不同程度的D2－40标记的LVD值增高［17－19］，本研究结果显示由 D2－40标记的微淋巴管具有一定的分布特点，在癌组织周边区淋巴管分布较多，且多为扩张状态。癌组织中心区淋巴管分布较少，且多为塌陷或闭塞状态。对照组淋巴管形态正常，分布于胃壁各层中，淋巴管数目较癌组织周边区少。提示这种情况可能是由于肿瘤组织内的淋巴管由于癌肿的压迫，癌细胞的侵袭及癌组织较高的组织间隙液体压力所造成的，这与Coskun等［20］的结论基本一致。Gao等［21］通过对63例胃癌研究发现瘤周LVD值与胃癌组织的大小及淋巴结转移具有相关关系。本研究结果经统计学分析显示，胃癌周边区LVD值与VEGF－C、－D表达及淋巴结转移密切相关，未发现LVD值与VEGF－A和FGF－2相关。Wang等［19］使用 Ki－67标记肿瘤淋巴管内皮增殖指数，发现胃癌周边区淋巴管内皮细胞增殖指数较高，提示多数功能性淋巴管为肿瘤周边淋巴管，而不是肿瘤内部的淋巴管，在肿瘤淋巴管新生和淋巴结转移中起重要作用。其他学者的研究中也有相似的报道［22－23］。

Hp－L型由于细胞壁缺失，难于维持原有的外部形态，而表现为球形、短杆状等多形性，其表面电荷改变，对宿主细胞表面的粘附性增强，使它易于在宿主细胞内定植［24］。目前Hp－L在消化性疾病中的作用已受到越来越多关注。于东红等［25］研究发现，胃癌组织中Hp－L型阳性率高达67．6%，不仅存在于癌巢、癌旁以及粘附在癌细胞表面，也可以位于癌细胞胞质内，提示Hp－L型感染与胃癌的发生相关。本实验通过对肿瘤组织中的Hp－L型检测，发现胃癌组织中Hp－L型阳性组的LVD值、VEGF－C、－D的表达阳性率高于Hp－L型阴性组，且差异有统计学意义（P＜0．05），说明 Hp－L型与胃癌的淋巴管形成有关，并提示Hp－L型可能是上调VEGF－C、－D的表达从而促进胃癌淋巴道转移的发生。其可能机制为：①Hp－L型在体内长期存活造成宿主细胞慢性损伤引起慢性炎症［26］。炎症时炎细胞释放的多种炎症介质包括VEGF在内的一类血管生长因子可刺激血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的增生，诱导淋巴管生成，使组织内LVD增加。新生的淋巴管管壁通透性较大，加之内皮细胞分泌的一些蛋白酶类使肿瘤细胞容易进入微淋巴管而发生淋巴道转移。②炎性渗出和组织水肿，加上大量增生的肿瘤细胞可造成局部组织缺氧。而低氧可以介导多种血管、淋巴管生长因子的表达增加，促进淋巴管生成，进而表现出LVD的增加［24］。本研究发现，在淋巴管密集区多有丰富的淋巴细胞浸润，且间质有大量纤维组织增生，提示肿瘤的转移是一个多因素参与的过程。

多因素Logistic回归分析发现，TNM分期和LVD值是胃癌淋巴结转移的相关因素，而VEGFC、－D、－A、FGF－2及 Hp－L型与胃癌淋巴结转移未见相关性，其结果与部分作者的研究相一致，同时与部分作者的研究结果也有相悖之处，究其原因可能与病例的选择，不同肿瘤组织生物学行为的多样性及分析方法的选择等有关。

总之，VEGF的表达在胃癌的淋巴管生成中具有重要作用，Hp－L型感染与胃癌的淋巴管生成具有一定的关系，通过检测Hp－L型、VEGF的表达和LVD值可有助于胃癌患者的预后判断，了解肿瘤的生物学行为及对临床治疗的选择，特别对以VEGF为靶点的抗肿瘤淋巴管形成的基因治疗提供了实验依据。

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