热休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纤维化过程中的作用

邓丽丽, 臧家娜, 应华忠, 余陈欢, 俞 冰

(1. 淅江中医药大学药学院, 杭州 310053; 2. 浙江省医学科学院实验动物中心, 杭州 310013)

热休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纤维化过程中的作用

邓丽丽1, 臧家娜1, 应华忠2, 余陈欢2, 俞 冰1

(1. 淅江中医药大学药学院, 杭州 310053; 2. 浙江省医学科学院实验动物中心, 杭州 310013)

目的 探讨热休克蛋白70(HPS70)在兔非酒精性脂肪肝(NAFLD)纤维化形成过程中的作用。方法 40 只雄性日本大耳兔随机分为正常对照组和NAFLD模型组，其中对照组取8周为时相点，模型组取4周、6周、8周3个时相点，每个时相点各10只。模型组分别皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周，每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。按时间点处死各组动物，测定兔血清中ALT、AST、TC、TG、FFA、空腹血糖(FBG)、HSP47、HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN的含量和空腹胰岛素(FINS)的水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR); MASSON染色观察肝组织病理形态改变; 免疫组化观察HSP47和HSP70的表达情况。结果 与对照组相比，模型组肝功能、脂质代谢和肝纤维化相关指标水平升高，造模4周时出现肝功能损伤，脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗，随着NAFLD肝纤维化进程的发展，HSP70表达量逐渐增加。结论 HSP70的表达与NAFLD肝纤维化程度呈正相关，可能与NAFLD肝纤维化发生发展密切相关。

非酒精性脂肪肝; 肝纤维化; 热休克蛋白70; 胰岛素抵抗

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是临床十大非传染性疾病之一[1～2]。依据病变肝组织中是否伴有炎症反应和纤维化，NAFLD可分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化[3]，其中NAFLD肝纤维化作为NAFLD临床病理发展过程中的一个亚型，是NAFLD进展为肝硬化、肝癌的必经阶段[4]。肝纤维化的发生并不是一个单一因素参与的过程，而是一种多基因、多因素、多途径共同参与的过程；这些因素互相影响、互相交叉，共同形成了一个复杂的网络[5]。HSPs是一种免疫蛋白，它既能通过模式识别受体激活先天免疫系统启动或促进炎症反应，同时作为前胶原的“分子伴侣”，参与机体内胶原合成，是胶原成熟的必要条件，它的表达影响胶原的产量[6]，表明其可能与纤维化形成有联系。据报道，HSPs家族的HSP47与HSP70都与形成多种纤维化有关，但与肝纤维化的相关研究尚未见报道。本实验通过兔皮下注射花生油建立NAFLD模型，动态检测兔NAFLD肝纤维化过程中HSP70在肝组织中的表达，以探讨HSP70在肝纤维化发展中的作用，也为该模型在脂肪肝发病机制方面提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性日本大耳兔40只，体质重2.0±0.2 kg。由浙江省实验动物中心提供[SCXK(浙)2009-0039];所有实验均在浙江省实验动物中心进行[SYXK(浙)2008-0114]。

1.2 实验试剂、仪器

丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、门冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、游离脂肪酸(FFA)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所; 兔生物指标ELISA试剂盒，均购于上海拜沃公司; 花生油(饱和脂肪酸: 单不饱和脂肪酸: 多不饱和脂肪酸=0.27∶1∶1)，购于东莞市鹏发粮油有限公司; 其余所用试剂均为分析纯。723N型可见分光光度计，上海精密科技有限公司; DM2500型荧光显微镜成像系统，莱卡仪器有限公司; 三诺安稳血糖仪，长江三诺生物传感技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及造模 将日本大耳兔随机分为正常对照组和NAFLD模型组, 其中正常对照组取8周为时相点，模型组取4周、6周、8周3个时相点，每个时相点各10只。模型组分别皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周, 每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。正常对照组隔天注射同体积的生理盐水。

1.3.2 取材 各时相点动物均于末次注射后禁食12 h,耳动脉取血，速眠新麻醉后颈动脉放血处死。以3 500 r/min，离心10 min，分离血清-80℃下保存备用。取同一部位肝组织装于10%中性甲醛中固定，用于病理切片。

1.3.3 指标测定 采用血糖仪测定空腹血糖(FBG)，采用比色法测定血清ALT、AST、TC、TG、FFA含量。采用ELISA法测定血清中热休克蛋白47(HSP47)、热休克蛋白70(HSP70)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层粘连蛋白(LN)、胰岛素(FINS)含量测定。具体操作步骤均按说明书进行。

胰岛素抵抗指数(HOMA- IR)= FINS×FBG/22.5

1.3.4 病理学观察 石蜡包埋肝组织标本制备4 μm切片, Masson染色, 光镜下观察肝组织病理变化。

1.3.5 免疫组织化学分析 免疫组化观察HSP47和HSP70在肝组织表达情况。

1.4 统计学分析

所有数据以x-± s表示，以SPSS17.0统计软件进行分析处理，组间有差异用t检验，组间没有差异用秩和检验。双变量正态分布资料采用Pearson相关分析，不服从双变量正态分布或等级变量资料相关性采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 血清生化指标的分析

与对照组相比较, 模型组各时间段血清中ALT、TC、FFA的值均升高, 有显著性差异(P＜0.01),FBG、FINS、HOMA-IR在第4周出现升高，到第8周达到最大值，且显时间依赖性(表1)。表明造模4周后出现肝功能损伤，高脂，胰岛素抵抗，且随造模时间的延长而加重。

各组兔肝纤维相关指标见表2。与对照组相比较，模型组各时间段血清中HSP47无显著性差异，但HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN值显著升高，且均具有统计学意义，表明模型组兔在造模4周后即发生明显的纤维化，且随造模时间的延长而加重纤维化程度。

2.2 肝组织病理形态观察

肉眼观察对照组兔肝脏无明显异常，模型组兔第4周肝脏为色红，质脆。6～8周肝脏被膜紧张、边缘圆钝、切面油腻、色淡黄，表面有花斑，质软。Masson染色检查，观察到正常对照组兔肝组织结构正常，细胞核大而清晰，胞质丰富，肝细胞无变性、坏死，无胶原纤维。模型组4周兔肝组织呈轻度脂肪病变，部分肝细胞胞质内有大小不一的脂肪空泡，并在汇管区、汇管区周围、纤维间隔内可见少量纤维组织增生(被蓝染)，出现纤维化; 模型6周组兔肝组织细胞出现肿胀多于4周组，细胞核大小不均，被脂肪空泡挤向一侧，纤维化扩展到门管区；模型8周组绝大部分肝细胞有脂肪空泡，纤维化扩展到门管区周围，呈星芒状放射(图1)。表明随着造模时间的延长，兔肝组织的纤维化程度进一步加重。

表 1 NAFLD肝纤维化兔血清生化指标的变化(n=10)

表 2 NAFLD肝纤维化兔血清肝纤维相关指标的变化(n=10)

2.3 免疫组织化学分析

HSPs表达物呈棕黄色颗粒，定位于细胞质中。对照组可见肝细胞质中有少量HSPs表达，其中HSP47的表达在不同时间相点模型中棕黄色分布几乎相同(图2)，表明HSP47在NAFLD肝纤维化进程中表达量无显著性变化。而HSP70则随造模时间的延长而棕黄色分布增多，颜色加深(图3)，表明HSP70在NAFLD肝纤维化进程中表达量有显著性变化，表达量逐渐增加。

2.4 相关性分析

分析实验兔HSP47与HSP70对肝纤维化的影响。采用Image-Pro Plus 4.0分析软件对NAFLD兔肝组织HSPs进行光密度值分析、多元线性分析[7～8],HSP70与HA、PCⅢ成呈正相关(P＜0.05)，与CⅣ和LN无相关性(表3)。而HSP47与肝纤维化指标均无相关性。以上结果表明HSP47与肝纤维化的形成发展无显著影响，而HSP70与油脂诱导兔肝纤维化的形成有关。

表 3 HSPs与肝纤维化指标的相关性分析(n=40)

图 1 兔肝组织病理学观察(MASSON 染色, ×200)

图 2 HSP47在兔NAFLD肝纤维肝组织表达情况(免疫组化×200)

图 3 HSP70在兔NAFLD肝纤维化肝组织表达情况(免疫组化×200)

3 讨论

3.1 皮下注射花生油造模

NAFLD肝纤维化动物模型的建立对研究肝硬化的发病机制、诊断和治疗是重要的前提。目前，建立肝纤维化模型的方法主要有以下几种: 四氯化碳(CCl4)诱发法、二甲基亚硝胺法、免疫诱发法、血吸虫感染法，酒精诱导法、高脂饲料喂养诱导法。其中CCl4诱导的肝纤维模型应用最早、最广泛，具有特性明确、形成性好，复制率高等优点，但其实验周期长，为8周到4个月不等，且死亡率高，与临床NAFLD肝纤维化复杂的脂质调控机制相去甚远; 同时，目前NAFLD研究最常用的大鼠模型在血脂代谢方面也与人类NAFLD特征有所区别[9～10]，存在高脂耐受的特点，极难形成肝纤维化，需连续高脂饲养6月以上方能少量形成NAFLD肝纤维化，存活率不足10%[11]。花生油是人们最常用的食用油之一, 具有热量高, 脂肪量大等特点, 日本大耳兔对致病胆固醇膳食的敏感性高。本实验选用花生油成功建立了肝纤维兔模型，成活率100%, 皮下注射花生油4周后兔肝组织MASSON染色呈轻度脂肪病变, 出现纤维化, 血清指标ALT、TC、FFA、HA、PCIII、CIV、LN值均显著升高，伴有脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗等症状，到第8周已完全形成NAFLD肝纤维化。

与传统方法比较，花生油皮下注射诱导日本大耳兔建立NAFLD动物模型，具有造模时短、肝脏取材量大，死亡率低、便于实时采血等优点，可简化实验操作步骤，节约实验成本。因此本实验的造模方法为快速、可靠地筛选NAFLD药物提供一种新的实验工具。

3.2 NAFLD纤维化机制初步分析

热休克蛋白(HSPs)是组织细胞受到外界因素刺激后应激产生的一种物质，是免疫应激和信号通路共同识别的生物标志物，在进化过程中具有高度保守性和同源性。以HSPs为中心的信号转导通路是当今生物医学研究领域中最活跃的主题之一，也是机体各种器官纤维化发生、发展及其复杂网络调控过程中的关键靶点[12～13]，它既能通过模式识别受体激活先天免疫系统启动或促进炎症反应，同时作为前胶原的“分子伴侣”, 参与胶原合成, 是胶原成熟的必要条件, 其表达影响胶原的产量, 能引导效应因子与Wnt蛋白结合而开启Wnt通路信号转导[14]。

研究发现HSP47在各种器官胶原异常聚集的纤维性疾病中均有所表达增加，如肺纤维化、心肌梗塞、肾小球肾炎等[15～16]，提示HSP47与器官的纤维化疾病进程有一定相关性。本实验结果显示NAFLD肝纤维化的进程中HSP47的表达并没有显著性变化，反而HSP70表达逐渐增加，并且与HA、PCⅢ的含量随NAFLD肝纤维化的进程增加的趋势一致。提示在NAFLD肝纤维化中，HSP70作为主导作用促进HA和PCⅢ的形成而形成肝纤维化。同时HSP70又具有肝保护作用，国外研究显示[17]，在急性肝损伤动物模型中HSP70对肝组织细胞有保护及再生的作用。因此可认为HSP70在NAFLD肝纤维化中既有保护肝细胞作用，又有促进肝纤维形成作用, 随着造模时间的延长, 机体组织超出一定的恢复期，HSP70失去其保护作用, 其促纤作用占主导地位，加重肝纤维化。综上所述，HSP70在NAFLD肝纤维化发展过程起重要作用, 可作为NAFLD肝纤维机制研究中的重要评价指标。

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Effect of HSP70 on Fibrosis of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rabbits

DENG Li-li1, ZANG Jia-na1, YING Hua-zhong2, YU Chen-huan2, YU Bing1
(1. Pharmaceutical College, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China;2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Zhejiang Center of Laboratory Animals, Hangzhou 310013, China)

ObjectiveTo investigate the change of HSP70 in nonalcoholic fatty (NAFLD) liver fibrosis of rabbit.MethodsForty male Japanese white rabbits were randomly assigned to control group and model group. The model group was divided into three subgroups, as 4-week, 6-week, 8-week groups, with 10 rabbits in each, and treated with peanut oil (1.2 ml/kg) subcutaneously (s.c.), twice a week for 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks respectively. The rabbits of all groups were sacrificed at the designed time point. Samples of serum were collected for detecting the serum ALT, AST, TC, TG, FFA,FBG, HSP47, HSP70, HA, PC?, C˘ô, LN ,and the HOMA-IR were calculated. The liver tissues were collected for histopathological and immunohistochemical observation.ResultsThe model groups had hepatic injury and high level of insulin at the beginning of 4 weeks. With the process of NAFLD liver fibrosis, HSP70 had gradually increased.ConclusionThe expression of HSP70 was positively correlated with NAFLD liver fibrosis, and it might have close relation with the development of NAFLD liver fibrosis.

NAFLD; Liver fibrosis; HSP70; HOMA-IR

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0107-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.006

2013-10-30

邓丽丽(1965-), 女, 硕士研究生, 从事疾病动物模型脂质代谢研究, E-mail: denglili485@sohu.com

俞 冰(1965), 女, 副教授, 从事疾病动物模型脂质代谢研究, E-mail: yhz0796@sina.com