一种改良的小鼠附睾尾常温运输方法

王美珊, 孔彭成, 朱 燕, 朱 莲, 陈学进, 李和平, 蒋满喜

(1. 东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨 150040; 2. 上海交通大学医学院实验动物科学部,上海 200025; 3. 上海市计划生育科学研究所, 上海 200032)

一种改良的小鼠附睾尾常温运输方法

王美珊1,2, 孔彭成2, 朱 燕3, 朱 莲2, 陈学进2, 李和平1, 蒋满喜2

(1. 东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨 150040; 2. 上海交通大学医学院实验动物科学部,上海 200025; 3. 上海市计划生育科学研究所, 上海 200032)

目的 探索常温条件下附睾尾运输的最佳条件，并消除培养液对常温运输可能存在的影响。方法 对附睾尾的运输方法进行了改良，同时比较了常温或4～8℃条件下，在20 μl或0 μl培养液M2中，运输后精子的活力、受精能力及其胚胎发育能力。结果 结果表明，常温运输不加培养液的条件下，运输的附睾尾精子活动率和活力，均优于20 μl培养液中运输的附睾尾，但是稍差于4～8℃条件下20 μl M2 培养液中运输的附睾尾。结论 无液体运输的方式更加适合于附睾尾的常温运输，同时该方法还可消除培养液对附睾精子可能存在的不良影响; 常温附睾尾的运输对于小鼠资源库或者研究机构间珍贵小鼠品系的运输具有重要的应用价值。

附睾尾; 运输; 精子活动率; 精子活力; 胚胎发育

过去的几十年里，大量转基因小鼠模型在生物医学研究领域不断涌现，并以指数级别的速度迅速增长，应运而生的小鼠资源库的建立促进了不同实验室或研究机构之间转基因小鼠品系的交换。尽管活体动物、冷冻胚胎或者精子都可以用来运输转基因小鼠品系，但是活体运输非常昂贵并且存在携带病原体的风险，而运输冷冻保存样品需要液氮罐之类的容器。新鲜精子运输可能是一个非常理想的选择，而且不需要特定的容器比如深冷液氮绝热运输罐(Dry shipper)等。但是很多研究表明，精子在常温或者低温条件下只能保存较短的时间[1～3]。最近有人发明了一种简单且成本较低的运输方法—附睾低温运输[2～7]，其优点在于可以避免在运输活体动物、冷冻胚胎和精子过程中出现的相关问题。

本试验采用常温(20～25℃)或4～8℃运输的方式, 附睾尾在 20 μl或 0 μl体积的培养液中运输 24 h后, 对附睾尾精子的活动率、活力及其受精能力进行了比较，最后还对IVF胚胎的体外和体内发育潜能进行了评估。以期消除常温运输条件下运输液对精子可能存在的不良影响，并对小鼠附睾尾的运输方式进行改良和优化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR小鼠(雄鼠大于10周龄; 雌鼠为3～4周龄)用作胚胎移植假孕受体的准备; 3～4周龄C57BL/6N雌鼠用于超数排卵处理、卵子的收集, 均为SPF级,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002], 饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部[SYXK (沪)2008-0050]。所有动物的使用均符合上海交通大学医学院实验动物科学部动物使用准则和动物福利的规定。10周龄以上的SPF级BDF1雄鼠来自东北林业大学, 进行附睾尾精子的原位运输。

1.2 主要试剂

孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波第二激素制药厂，其他试剂若无说明，均购自Sigma-Aldrich公司。

1.3 附睾尾在常温及低温(4～8℃)条件下的收集与运输

取成年BDF1雄鼠，断颈椎处死，无菌条件下剪开皮肤并在阴囊上切口，依次取出两侧附睾尾, 分别置于两个0.2 ml的离心管中, 并加入0 μl或20 μl的M2培养液, 扣合封口。然后将其放置于保温杯内经过4 ℃或常温(20 ℃)预温的凝胶冰袋上, 用胶带固定, 然后在保温杯内放置专门的RC-4温度记录仪(江苏精创电气股份有限公司)以确保温度的可靠性, 最后将保温杯放入经过同样预温的泡沫盒中[5],低温运输的温度范围保持在4～8 ℃, 常温运输的温度范围保持在20～25 ℃。然后将装有附睾尾样品的泡沫盒通过快递或者专门人员携带的方式运输。

1.4 附睾精子的分离和获能

24 h内，附睾尾样品送至上海交通大学医学院实验动物科学部, 并立刻移至400 μl经过37 ℃预温的HTF体外受精液(密理博公司)中取出精子, 并在37 ℃、5% CO2条件下分别获能30 min、90 min、120 min。

1.5 精子活力的评估

将获能处理30、90、120 min的样品按照1∶8的比例分别加入20 μl的HTF培养液中测定精子活力。在200倍显微镜下按照Jequier和Crich的方法[8]进行精子活力的测定，并对活动精子数和精子活率进行评估。精子活力指数可分为0～4五个评定等级: 0代表不运动，1代表弱或缓慢运动, 2代表运动，3代表运动良好，4代表运动活跃。并统计运动活跃的2～4级精子在整个样本中的百分率。

1.6 精子受精能力的评估

C57BL/6N雌鼠(4～6周龄)分别注射7.5 U PMSG和hCG(间隔48～50 h), hCG注射后13～15 h收集MII期卵子, 并将取出的卵子在HTF培养液中清洗3次后转移到500 μl的HTF授精滴中。IVF参照Byer等方法[9], 获能90 min后的精子加入含有卵子的HTF授精滴中(精子终浓度为2×105个/ml), 然后在37℃、5% CO2条件下共孵育5～6 h。最后选出受精卵并在HTF中进行清洗若干次, 继续培养。

受精后24 h, 统计2-细胞胚胎的数量。然后将胚胎在KSOM-AA(密理博公司)液滴中清洗干净，每10～15枚胚胎一组放入覆盖有无菌石蜡油的20 μl KSOM-AA液滴中继续培养。受精72 h后, 统计发育到囊胚期的胚胎数。以全部受精卵数为基数，计算2-细胞胚胎和囊胚的发育率。

1.7 胚胎移植

提前准备ICR假孕小鼠, 将囊胚移植到假孕2.5 d小鼠中。妊娠18.5 d后，通过剖宫产或者自然分娩的方式获得仔鼠。

1.8 统计分析

每个实验组均重复3～4次。采用χ2检验分析IVF受精率、2-细胞胚胎率和囊胚率。采用t检验分析获能后精子活动率和精子活力。P＜0.05为统计学差异显著。

2 结果

2.1 培养液和温度对小鼠精子活动率和精子活力的影响

结果显示(图 1), 附睾尾常温无培养液运输的精子, 在30 min、90 min、120 min的获能后, 其活动率分别为76.1%±2.2%、73.4%±1.5%、70.8%±2.3%, 与4～8 ℃加20 μl培养液运输的精子活动率之间无显著差异(75.0%±1.4%、73.3%±3.1%和71.4%±2.0%; P＞0.05)，优于常温加20 μl培养液组(55.2%±2.0%、51.8%±2.4%和49.3%±3.4%; P＜0.05)。

附睾尾精子孵育30 min、90 min、120 min后, 常温无培养液组的精子活力分别为2.0±0.3、2.1 ± 0.2、1.8 ± 0.1，比 4～8 ℃加 20 μl培养液组略低(2.9±0.2、3.2±0.1和3.1±0.2; P＜0.05)，但是明显优于常温加20 μl培养液组(1.5±0.0、1.6±0.2和1.3±0.1; P＜0.05)。

2.2 常温及4～8℃条件下运输小鼠附睾尾精子的IVF率及其胚胎体外发育

结果显示，常温或4～8℃运输附睾尾, 并检测附睾精子的IVF能力(表1)。BDF1小鼠的附睾精子于37℃获能90 min, 然后用于IVF。4～8 ℃、20 μl培养液运输的附睾尾精子的受精率为62.5%，而常温20 μl培养液和常温无液常温组精子的受精率分别为1.9%和20.2%，差异显著(P＜0.05)。4～8℃、20 μl培养液和无液体常温运输组中，其2-细胞胚胎和囊胚的发育率均较高(50.3%、51.7%; P＞0.05),而且胚胎移植后分别获得12和9只仔鼠，表明常温无培养液的条件下进行附睾尾运输是可行的。

图 1 BDF1小鼠常温及4～8 ℃运输附睾尾在不同培养液体积情况下的精子活动率和精子活力

表 1 4～8℃或常温运输的附睾精子IVF后胚胎的发育情况

3 讨论

已有研究表明，常温或低温条件会对小鼠精子短期储存产生一定的影响[2,10～11]。小鼠精子在24℃的TYH培养液中储存24 h仍可维持较强的受精能力。但是常温条件下超过24 h后，精子很难维持正常的受精能力[10]。另一项研究专门比较了M2、PB1、M16、CZB和TYH对小鼠精子的影响，认为M2是常温精子储存的最佳液体[2]。

最近, Takeo等[11]比较了石蜡油、M2、CPS-1和Lifor对4～8℃冷藏精子受精能力的影响。他们发现在冷藏储存72 h后, 在维持附睾精子受精能力方面，Lifor比M2以及石蜡油的效果好。这项研究表明，作为一种人造器官的保存液，Lifor含有糖类、氨基酸、无机盐、缓冲剂、胶体以及氧气和营养物质的载体脂质(纳米粒子)[12～13]，并证明Lifor对于短期冷藏储存小鼠精子是非常有益的。

本研究中，BDF1小鼠附睾尾来自于距离本实验室2 000 km以外的单位。在常温和4～8 ℃运输过程中，使用了20 μl和0 μl两种体积的培养液。最终发现，常温运输与4～8℃运输相比，在不使用培养液(0 μl)的情况下，精子存活率在运输24 h之内受到的影响不大。但由于精子活力受到了某种程度的影响, 其受精率低于4～8℃、20 μl培养液运输的精子(20.2% vs 62.5%)。但是常温、20 μl培养液中运输的精子，其受精率受到极大的影响，仅为1.9%。因此，常温无培养液运输的小鼠精子进行IVF后能够获得可以接受的受精率。而且与4 ℃运输一样，移植后均可成功获得健康的后代。证明各研究机构之间通过常温运输方式进行小鼠品系交换的安全性和可行性。而且经过改良的无培养液的方法更有益于24 h内附睾尾的常温运输，并消除培养液可能存在的影响。

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A Modified Delivery of Mouse Cauda Epididymides at Room Temperature

WANG Mei-shan1,2, KONG Peng-cheng2, ZHU Yan3, ZHU Lian2, JIANG Man-xi2, CHEN Xue-jin2, LI He-ping1

(1. College of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;2. Department of Laboratory Animal Sciences, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; 3. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China)

ObjectiveTo explore the optimal conditions for Cauda epididymis transport under room temperature and eliminate the effect of medium on the transport of cauda epididymides at room temperature.MethodsThe transportMethodsof cauda epididymides were modified in this study and the sperm motilities, fertility and developmental abilities of IVF embryos after transportation at room temperatures or 4～8℃ in 20 μl of medium M2 or medium-free tube were compared.ResultsUnder room temperatures,delivery of cauda epididymides without medium was significantly superior to with medium, but was inferior to 20 μl M2 medium under 4～8℃.ConclusionThe modified medium-free system was beneficial to room temperature transportation of cauda epididymides and maybe eliminate the side effects of medium on spermatozoa, and the delivery of cauda epididymides under room temperature was useful for transporting some valuable strains between mouse banks and research facilities.

Cauda epididymis; Transport; Sperm viability; Motility; Embryo development

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0145-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.013

2013-09-04

国家自然基金(编号:81170756/H0713)

王美珊(1987-), 女, 硕士研究生, 从事转基因动物与发育生物学研究。

E-mail: meishan200703@126.com

蒋满喜, 博士, 助理研究员, 长期从事动物受精、发育生物学与转基因动物研究,E-mail: manxijiang@yahoo.com

李和平, 教授, 长期从事动物遗传育种与繁殖学研究, E-mail: 461905800@qq.com