二级蒸馏对竹醋液抑菌与抗氧化效果的影响

安 琳， 张 燕， 崔 宇， 王友升，*

（1.北京工商大学食品学院/北京市食品风味化学重点实验室/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.江阴中利生物技术有限公司，江苏江阴 214400）

二级蒸馏对竹醋液抑菌与抗氧化效果的影响

安 琳1， 张 燕1， 崔 宇2， 王友升1，*

（1.北京工商大学食品学院/北京市食品风味化学重点实验室/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；
2.江阴中利生物技术有限公司，江苏江阴 214400）

比较了一级蒸馏和二级蒸馏竹醋液的抑菌效果以及其自由基清除能力、总酚和总黄酮的含量，并通过高效液相色谱对相关活性组分含量进行分析.结果表明：一级蒸馏和二级蒸馏竹醋液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠酵母、黑曲霉均表现出较好的抑制效果和较强的抗氧化能力，但二级蒸馏会显著降低竹醋液的抑菌能力及抗氧化能力.此外，高效液相色谱检测结果表明，二级蒸馏后竹醋液在254 nm和270 nm波长下吸收峰的数量和峰面积均显著降低.

竹醋液；二次蒸馏；抑菌；抗氧化；高效液相色谱

竹醋是竹炭生产的副产物，即竹材经炭化、热解产生的具特殊焦烟气味的黄色或红褐色液体［1］.竹醋具有去异味、杀菌、除虫、抗病毒、促进植物生长、防止血糖降低等作用，因此作为一种绿色、天然、环保的新资源，竹醋在农业、医疗、化工食品等领域具有良好的应用前景［2-3］.研究表明，竹醋可以延缓草鱼肉块腐败变质，延长其货架期［4］.竹醋与壳聚糖复配用于圣女果保鲜，既可延长保藏时间，又不损害果实的外观及品质［5］.竹醋的超氧阴离子、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力与茶多酚相近［6-7］，但竹醋液具有的特殊焦烟气味可能会影响食品的风味，从而限制其在食品保鲜中的应用.因此，需要对竹醋液通过二级蒸馏进行精制，精制后的竹醋液较原液更加透明，烟熏酸味变淡［8］.然而，二级蒸馏后对竹醋液的抑菌能力、抗氧化能力及功效组成成分含量的影响还鲜有报道.因此，本研究考察并比较了竹醋一级蒸馏和二级蒸馏液的抑菌性能、抗氧化性及代谢指纹图谱，以期为将精制竹醋液开发成抑菌、杀菌、防腐剂等产品提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品

竹醋液由江阴中炬生物科技有限公司提供，制作纯化采用江阴中炬生物科技有限公司2010-1型竹木醋提取提纯设备.竹醋液制备工艺为竹材破碎后制成竹片，然后将其干馏和炭化，进行两级冷凝，并将两级冷凝所得的竹醋液在混合罐中混合后静置.将pH值为2.5～3.0的竹醋液置于40～100℃、真空度0.080MPa以上的条件下进行一级蒸馏，至馏出体积为原液体积的80%～90%时即可，所得到的馏出液，进行冷凝归集.将一级蒸馏液置于40～100℃、真空度0.085 MPa以上的条件下进行二级蒸馏，至馏出体积为原有体积的80%～90%时即为二级蒸馏液.

1.1.2 试剂

三吡啶三吖嗓（TPTZ）、2，2＇-联氮-双-（3-乙基苯并唾唑啉-6-磺酸）（ABTS）、二苯代苦味酰基（DPPH）等均购于Sigma-Aldrich公司.色谱纯的甲醇和乙酸购自Fisher公司，其他试剂均为分析纯.

1.1.3 菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠酵母（Canidia albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）均为本实验室保存.

1.1.4 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，加水补足1 L，121℃灭菌15 min.LB培养基：胰蛋白陈10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，琼脂18 g，加水补足1 L，用NaOH调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌15 min.YPD培养基：酵母浸粉10 g，蛋白陈20 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，加水补足1 L，121℃灭菌15min.

1.2 实验仪器

DH 500 AB型电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；SHH-50L型生化培养箱，重庆四达实验仪器有限公司；MJX-250Ⅱ型霉菌培养箱，广州省医疗器械厂；T6型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；QL-901型振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；CL200+型笔式余氯/pH/ORP计，上海三信仪表厂；ES-300A型电子天平，长沙湘平科技发展有限公司，1100型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC），安捷伦公司；UV2450型分光光度计，Shimadzu公司.

1.3 测定方法

1.3.1 滤纸片扩散法测定抑菌作用

取竹醋液于超净工作台中用无菌水配成体积分数为70%，50%，30%，20%，10%的稀释液.取50 μL菌悬液（细菌浓度为1×106个/m L，真菌为1× 105个/m L）铺板，将滤纸片放至平板中央，加30μL样品，以水作对照.适温培养（细菌37℃培养，霉菌25℃培养，酵母28℃培养），待对照长满后，测量抑菌圈直径.

1.3.2 比浊法测定杀菌作用

每支试管加入2.5mL配置好的样品-培养基混合物，然后再加入0.5mL菌悬液，菌悬液浓度分别为：细菌1×107个/mL；白色念珠酵母1×107个/mL；黑曲霉600 nm下的透光度T=75%（±2%）.充分震荡后，摇床培养，细菌37℃、150 r/min，黑曲霉的培养条件为25℃、150 r/min，酵母的培养条件为28℃、150 r/min.培养24 h.取50μL菌液涂板.E.coli、S.aureus于37℃培养，A.niger于25℃中培养，酵母于28℃培养.待对照长满板后，观察结果.

1.3.3 抗氧化指标的测定

总抗氧化能力的测定参考文献［9］并略有改进.测量体系含0.2mL样品，3mL TPTZ工作液和0.3mL醋酸盐缓冲液（0.3 mol/L，pH=3.6），37℃下放置45min后于593 nm下测其吸光度，样品总自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示（U/mL）.

参考文献［10］进行清除DPPH自由基能力的测定，将对DPPH自由基50%清除率定义为1个活性单位（U），清除DPPH自由基能力以每克鲜重样品中含有的活性单位来表示（U·（g·fw）-1）.

经自由基清除能力的测定依据刘骏的方法［11］.将对经自由基50%清除率定义为1个活性单位（U），清除经自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示（U/mL）.

总还原能力的测定参考文献［12］.0.2 mL样品，1.0m L磷酸缓冲液（PBS）（0.2 mol/L，pH值为6.6）和1.0m L 1%铁氰化钾混合均匀，于50℃水浴锅中放置20min，取出后立即冷却，体系降温后加入1.0mL 10%三氯乙酸（TCA），充分混匀后取出1 mL，再加入2m L蒸馏水和0.3mL 0.1%FeCl3，放置10 min后于700 nm下测其吸光度.

超氧阴离子能力的测定采用氮蓝四唑光照法［13］.将对超氧阴离子50%清除率定义为1个活性单位（U），清除超氧阴离子自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示（U/mL）.

1.3.4 总酚和总黄酮的测定

总酚的测定参照文献［14］，略有改进.以没食子酸作标准曲线，样品的总酚含量换算为每毫升样品中没食子酸的含量（μg/m L）.

总黄酮的测定参照文献［15］进行.以芦丁作标准曲线，样品中总黄酮含量换算为每毫升样品中芦丁的含量（μg/m L）.

1.3.5 竹醋的HPLC指纹图谱分析

竹醋样品采用HPLC，选用254，270 nm波长进行分析.色谱条件：ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为1%乙酸水溶液（B）-甲醇（C）；梯度洗脱为流速1 mL/min；进样量10μL；二极管阵列检测器（DAD），设定波长254 nm和270 nm.

2 结果与分析

2.1 二级蒸馏对竹醋液抑菌效果的影响

竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液的抑菌效果的比较结果见表 1.由表 1可见，竹醋液对E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A.niger均表现出不同程度的抑制作用，且其中一级蒸馏液的抑菌效果均优于二级蒸馏液.与一级蒸馏液相比，二级蒸馏液对E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A. niger的抑菌圈直径分别减小了31.48%，15.38%，34.78%，47.62%，50.85%，表明将竹醋液二级蒸馏可降低其抑菌效果.

2.2 二级蒸馏对竹醋液杀菌效果的影响

表2比较了竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液对5种指示菌的致死浓度.结果表明，两种竹醋液对液体培养的E.coli、P.aeruginosa、S.aureus、C.albicans、A.niger均表现出较强的抑制作用，浓度为25%及以上的竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液可完全抑制5种受试菌的生长.此外，由竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液再铺板结果可知，两种竹醋液对E.coli及C.albicans的最低杀菌浓度均为5%.而竹醋一级蒸馏液对P.aeruginosa、S.aureas及A.niger的最低杀菌浓度均低于二级蒸馏液.可以看出二次蒸馏处理促进竹醋的最低杀菌浓度升高.

表1 2种竹醋液的抑菌效果比较Tab.1 Comparison of antimicrobial effects of two bamboo vinegars

表2 竹醋液对5种供试菌的致死浓度Tab.2 Lethal concentration of two bamboo vinegars against variousmicroorganisms

2.3 二级蒸馏对竹醋液抗氧化能力的影响

表3对竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液抗氧化能力进行了比较.结果表明，与一级蒸馏液相比，竹醋二级蒸馏液的DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力、超氧阴离子清除能力、总还原能力分别下降了64.48%，94.66%，59.92%，90.46%.而竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液的经自由基清除能力并无明显差异.

表3 2种竹醋液的抗氧化能力比较Tab.3 Comparison of antioxidant activities of two bamboo vinegarsU·mL-1

2.4 二级蒸馏对竹醋液总酚、总黄酮含量的影响

表4对竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液中总酚，总黄酮含量进行了比较.结果表明，竹醋一级蒸馏液中的总酚、总黄酮质量浓度分别为60.23μg/mL 和93.59μg/m L，而二级蒸馏液中的总酚、总黄酮质量浓度仅为21.91μg/mL和4.41μg/mL，分别减少了63.62%和95.29%.

表4 2种竹醋液中总酚和总黄酮含量的比较Tab.4 Comparison of contents of total phenolic compounds and total flavones in two bamboo vinegars

2.5 二级蒸馏对竹醋液功效成分的影响

取竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液样品分别进行HPLC指纹图谱分析，测定两种样品在254 nm和270 nm波长下的吸收峰，见表5.结果表明，竹醋一级蒸馏液样品在254 nm波长下通过分析获得22个吸收峰，在270 nm波长下得到27个吸收峰.而竹醋二级蒸馏液样品在254 nm下仅获得1#、4#、7#、9#和13#5个吸收峰，这5个峰峰面积分别为875.7，393.8，64.0，46.7，34.0 mAU·s，均显著低于一级蒸馏液吸收峰面积.此外竹醋二级蒸馏液样品在270 nm下仅获得1#、6#、11#、12#和15#5个吸收峰，峰面积分别为 182.1，1 048.7，130.9，26.7，77.4 mAU·s，与竹醋一级蒸馏液相比，二级蒸馏液峰面积值分别降低了63.52%，29.79%，75.61%，92.74%，86.46%.以上结果表明，二级蒸馏过程将造成竹醋液中酚类及黄酮类等功效活性成分的损失.

表5 2种竹醋样品在254，270 nm下的吸收峰面积Tab.5 Area of absorption peaks at 254 nm and 270 nm of two bamboo vinegars

3 讨 论

竹醋液是一种广谱抑菌剂，对包括细菌、霉菌、酵母菌在内的5种指示菌的生长均具有良好的抑制效果，其中质量分数在25%以上两种竹醋液均可完全抑制5种指示菌的生长.常雅宁等［16］研究发现，竹醋液对黄曲霉菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制杀灭作用.李忠琴等［17］测定了竹醋对食品和水果中不同类型腐败菌的抑制效果，结果显示，竹醋液对细菌和真菌均具有较强的抑制作用，与本实验结论一致.同时，本研究的结果表明，竹醋液具有较强的清除DPPH自由基、经自由基、超氧阴离子能力及还原能力，并含有丰富的酚类及黄酮类抗氧化活性成分，因此具有良好的抗氧化效果.常雅宁等［6］的研究也表明竹醋液在清除氧自由基和油脂抗氧化方面具有良好性能.

本研究还发现，与一次蒸馏后的竹醋液相比，二次蒸馏后竹醋液对5种受试菌的抑菌杀菌效果明显降低，同时最小杀菌浓度也相应升高，且二次蒸馏后竹醋液的抗氧化能力降低，总酚类和总黄酮类的含量及种类减少.黄酮及多酚在植物中广泛存在，多具颜色，由黄色至棕红色不等.经二次蒸馏后，竹醋液颜色更为清亮，推测可能与总酚、总黄酮的流失有关.作为重要的植物次生代谢产物，多酚和黄酮是许多植物的功效组分，具有很强抗氧化和清除自由基作用［18-19］及消炎［20］、抗菌［21-22］、抗肿瘤［23］活性.因此二次蒸馏后竹醋液的抑菌活性、抗氧化活性受损可能与其总酚、总黄酮含量的降低密切相关，但是否为其主要原因还有待进一步研究.且竹醋中酚类和黄酮类物质种类繁多，其中影响竹醋抑菌活性及抗氧化活性的主要成分也需要继续探讨.

二次蒸馏后竹醋样品中酚类、黄酮类吸收峰的面积和数量均显著降低，说明二次蒸馏不仅会降低竹醋中酚类、黄酮类的含量还会影响其种类.张文标等［24］采用GC-MS对竹醋液进行组分分析发现，竹醋液含有有机酸、酚类、酮类、醇类、醛类等80多种主要物质.庄晓伟等［25］利用GC-MS分析比较竹醋液及精制液中各组分含量的差异，发现竹醋液原液的酚类、醛类、酮类物质比精制竹醋液高44.6% 和10.6%，与本实验结果相符.因此，在加工过程中，在尽量消除竹醋液不良风味的同时，保持竹醋液原有的功效组分并提高其抗氧化活性及抑菌活性，使其在天然植物源杀菌剂与功能性食品及食品添加剂开发中得到更好应用，仍需要进一步探讨.此外，如何排除在竹醋液蒸馏制备过程中可能产生的毒害物质，如某些醛类及醇类物质等，使其得到更好的应用，需要在下一步实验中深入研究.

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Effect of Secondary Distillation on Antim icrobial and Antioxidant Activities of Bamboo Vinegar

AN Lin1， ZHANG Yan1， CUIYu2， WANG You-sheng1，*
（1.School of Food and Chemical Engineering/Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry/ Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；
2.Jiangyin China Grand Biotechnology Co.Ltd.，Jiangyin 214400，China）

The antimicrobialactivities，free radical scavenging capacity，the contentof totalphenols，and total flavonoids of primary and secondary distilled bamboo vinegarwere investigated.In addition，the primary and secondary distillation bamboo vinegarwasanalyzed for themain bioactive compounds by HPLC. The results indicated that the bamboo vinegar displayed strong antimicrobial activities againstEscherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，andCanidia albicansandAspergillus niger，and free radical-scavenging properties.However，antioxidant capacity and antimicrobial activities of secondary distilled bamboo vinegar were significantly lower than these of primary distilled bamboo vinegar.The HPLC fingerprint showed that the peak numbers and areas of secondary distilled bamboo vinegar at 254 nm and 270 nm were obviously lower than these of primary distilled bamboo vinegar.

bamboo vinegar；distillation；antimicrobial；antioxidant；HPLC

叶红波）

TS205；S201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.007

2095-6002（2014）01-0034-06

安琳，张燕，崔宇，等.二级蒸馏对竹醋液抑菌与抗氧化效果的影响.食品科学技术学报，2014，32（1）：34-39. AN Lin，ZHANG Yan，CUIYu，et al.Effect of secondary distillation on antimicrobial and antioxidant activities of bamboo vinegar.Journal of Food Science and Technology，2014，32（1）：34-39.

2013-05-09

北京市属高等学校人才强教计划资助项目（PHR201108082）；2012年国家创新基金资助项目（12C26213202444）.

安 琳，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术；*王友升，男，副教授，博士，主要从事食品生物技术方面的研究.通讯作者.