新疆泥火山群土壤真菌群落的DGGE分析

张亚平，曹小妮，路盼盼，余鹏，李建辉

（石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）

新疆泥火山群土壤真菌群落的DGGE分析

张亚平，曹小妮，路盼盼，余鹏，李建辉

（石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）

采用DGGE指纹图谱技术对新疆乌苏的泥火山区的土壤真菌群落18SrDNA进行电泳分离，通过Quantity one软件对图谱进行聚类分析，并对主要条带进行回收测序。DGGE图谱聚类分析显示，五月份表层土真菌的种类和数量丰富。群落结构在相同季节垂直分布上相似性较高，聚集到一个分支上；而不同季节土样真菌组成差异较大。特异条带的回收测序结果表明，泥火山真菌优势菌群为链格孢属真菌和多枝横梗霉属。新疆泥火山土壤真菌的多样性较高但数量偏少，受气候环境因素的影响较大，优势菌群受此影响较小。

泥火山；18SrDNA；DGGE

泥火山是以喷发泥浆水为主的火山，由于其喷发口内温度恒定且较低，又称凉火山。泥火山是在特定地质条件下形成的罕见自然地质景观，是地层内部圈闭气体由于压力释放上冲的结果[1]。目前，中国最大的泥火山群分布在新疆乌苏一带，形成新疆乌苏泥火山群。而且含有丰富的煤矿和油藏，这种特殊环境中微生物产生一系列适应油气、低温、盐碱、寡营养、冷暖交替等极端因子的分子多态性，这些特殊多样的微生物资源，具有发展生物技术产业的资源优势[2-5]。国内外学者越来越重视泥火山研究[6]。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术，是近几年发展起来的广泛用于研究微生物多样性的分子生物技术[7]。能快速有效地分析某一特定环境的微生物群落结构，了解其种群动态，是研究土壤微生物群落的有效手段[8-12]。本文以新疆乌苏泥火山群为研究对象，首次利用DGGE技术分析泥火山土壤真菌群落结构及演替规律。

1 材料与方法

1.1 土样的采集

分别于2010年5月、8月、10月赴新疆乌苏泥火山群采集土壤样品。在采样地根据样地的地形和土壤类型，选取之字形多点采样方法采集土壤样品。采样之前，先用该处土壤反复擦拭铁铲，每样点取5个层次的土壤，取样深度依次为0～10 cm，10～20 cm，20～30 cm，30～40 cm，40～50 cm。

1.2 真菌总DNA的提取纯化

主要方法步骤参照文献[13]：①称取充分研磨5 g土样，加入13.5 mL DNA提取液（100 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1Na3PO4，1.5 mol·L-1NaCl，1%CTAB，pH 8.0）和20颗直径为3 mm左右的玻璃珠，充分震荡3 min。②加入500 μL溶菌酶（50 mg·mL-1），震荡30 s，37℃水浴30 min：之后加入纤维素酶和蜗牛酶，37℃水浴30 min[14]；加入20 μL蛋白酶K（20 mg·mL-1），震荡30 s，37℃水浴30 min。③加入1.5 mL 10%SDS后，-20℃放置1 h，65℃水浴1 h（每隔15 min上下颠倒晃动几次），重复此操作2次。④6 000 g离心10 min；取上清液，用等体积苯酚和氯仿∶异戊醇（24∶1）各抽提2次，12 000 g离心15 min，取上清。⑤加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2 h或过夜，12 000×g离心15 min，弃上清。⑥沉淀加5 mL预冷70%乙醇，12 000 g离心20 min，收集DNA沉淀，风干，适量双蒸水溶解。

1.3 基因组DNA 18SrDNA的片段扩增

采用天根生化科技（北京）有限公司提供的凝胶回收试剂盒，对提取得到的基因组DNA进行回收纯化。采用巢氏PCR的方法对其扩增。引物的选取参照文献[15]。

选取真菌通用引物EF4f/Fung5r扩增，反应体系（20 μL）：10×buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，TaqDNA（5 U·μL-1）0.6 μL，模板1 μL，ddH2O 11.4 μL。反应程序为：94℃5 min；94℃30 s；54℃30 s；72℃2 min；35个循环；72℃10 min；4℃保存。

二套扩增引物为EF4/R518GC，反应体系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，TaqDNA（5 U·μL-1）0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 13.4 μL。反应程序为：94℃5 min；94℃30 s；54℃30 s；72℃2 min；40个循环；72℃10 min；4℃保存。

1.4 DGGE分析

采用Bio-Rad电泳系统，对PCR产物进行分离。制备8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为40%～60%，样品加样量为15 μL，电泳条件为60℃，130 V，1×TAE电泳6 h，电泳胶的染色方法参照Bassam的银染方法[16]，DGGE条带采用Quantity One软件分析。

2 结果与分析

2.1 18SrDNA片段PCR扩增

选取部分土壤总DNA分别以EF4、Fung5r和R518GC、EF4为引物做巢式PCR，扩增产物片段大小分别为534 bp，400 bp；以1%琼脂糖检测电泳结果见图1。

图1 一扩二扩的PCR产物Fig.1 Profile of the first round and the second round PCR products

2.2 DGGE图谱多样性分析

以R518GC和EF4为引物进行PCR扩增，对扩增后的产物进行DGGE指纹图谱分析，分别得到不同土壤样品的DGGE图谱（见图2）。DGGE图谱中条带的数目代表不同月份不同土层真菌的丰富度，条带的信号强度代表真菌种属的数量，因此该DGGE图谱可以用来反映泥火山土壤真菌的多样性差异。图2中，每个土壤样品都有其特异性的条带,把不同月份的条带进行相互比较可以得出：五月份土样中0～10 cm土层丰富度最高，八月份10～20 cm土层丰富度最高，十月份30～40 cm土层丰富度最高，不同月份的土样表现出极大的相似性。由此可以推出随着时间的推移，泥火山土壤真菌由表层土壤向深处迁移的趋势。

2.3 样品相似性分析

图2用Quantity One软件（Bio-Rad）对其做DG⁃GE图谱分析，并绘制系统树，该系统根据戴斯系数CS（Dice coefficient）按照有关方法（UPGMA算法）计算绘出（见图3）。CS=2j/（a+b），j是样品A和B共有条带，a和b分别是样品A和B中各自的条带数。戴斯系数的范围是从0（无共同带）到1（所有的条带相同），由戴斯系数可得相似性矩阵（见表1）。

图2 PCR产物的DGGE电泳图谱Fig.2 DGGE profiles of the PCR products

表1 DGGE图谱的相似性分析Table 1 Similarity Analysis of DGGE patterns

从表1可知，1、2、3泳道的相似性约为70%，而与4和5泳道的相似性约为30%，可见五月份的浅层土壤真菌组成相对于深层土壤变化较小，群落结构更为稳定。结合聚类分析图3可知，泳道1、2、3、4相对于其他泳道分支相似性较高。把聚类分析图与相似性矩阵相结合，得出不同月份的不同土层真菌组成差异性较大；而不同月份同一土层相似性比较，5月份与10月的表层土相似性系数为62.4%，而与8月份的表层土相似性系数只有21.2%；3个不同月份深层土壤40～50 cm土层群落结构较稳定，变化不明显，群落结构受气候环境因素的影响较大，受地温影响较小。

2.4 克隆子序列的Blast分析

DGGE图谱中广泛分布的条带，标记为A、 B、C，对其进行条带回收及克隆测序，BLAST比对结果如表2。

由表2可知，序列同源性达到97%以上时可确定为同一种，同源性达到95%以上可把这些菌归为同一属[17]。比对结果表明是链格孢属和多枝横梗霉属，为泥火山土壤中的优势种群。

图3 DGGE图谱聚类分析Fig.3 Dendrogram showing the relatedness of the DGGE banding patterns

表2 测序比对结果Table 2 Sequence alignment with blast

3 讨论

DGGE是一种能够快速有效地检测土壤微生物群落多样性及动态变化的分子生物学技术。本文利用该技术对新疆乌苏泥火山不同月份和不同深度土壤真菌群落结构及变化进行研究。

通过对新疆泥火山真菌的DGGE图谱分析，结果表明泥火山真菌多样性较高但数量偏少，相同季节不同深度真菌多样性相似，群落结构稳定；其优势菌群为链格孢属和多枝横梗霉属。较丰富的真菌在3个季节的不同土层都有所分布，随季节变化会产生一定迁移现象：由表层土壤向至深层土壤迁移。说明环境气候，生态环境等因素对泥火山真菌群落分布影响较大，但优势菌群受其影响较小。

可培养方法和DGGE电泳技术相结合分析表明泥火山真菌优势菌群为链格孢属和多枝横梗霉属。而新疆泥火山气候干旱，常年高温，土壤贫瘠，高盐碱，各种矿物元素含量偏低，这种条件能够满足低等真菌的繁殖。结合泥火山的极端环境及菌属特征分析：链格孢属为半知菌门和横梗霉属真菌为接合菌亚门毛霉属，是土壤常见菌属。其中毛霉属菌喜高温高湿环境，多为工业发酵菌[18]，其功能特性有待深入研究。

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Analysis of the fungi communities in mud volcano soils in Xinjiang using DGGE

ZHANG Yaping,CAO Xiaoni,LU Panpan,YU Peng,LI Jianhui
(School of Life Science,Shihezi University,Shihezi Xinjiang 832003,China)

Reveal the bacterial community structure and dynamics in mud volcano soil in Xinjiang.18S-rDNA-ragmentDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)andclonesequenceBLAST technologies were applied,quantity one software was used to map the dendrogram.The cluster analysis of DGGE profiles showed that the number of species of fungi were the most abundant in the surface soil of May and community structure during the same season of the vertical distribution of high similarity,clustered into a branch;and fungi in soil samples composed of different seasons were quite different.The recovery of specific bands sequencing result showed that mud volcano fungi as Alternaria dominantfungi wereAlternaria tenuissima.sp andLichtheimia ramosa.sp.The fungi polymorphism in mud volcano soil in Xinjiang was significant,but the quantity was few,and this diversity was vulnerable to ecological,climatic and other factors.But the dominant microorganisms affected less.

Mud volcano;18SrDNA;DGGE

Q938.1

A

1005-9369（2014）04-0066-05

2014-03-17

国家自然科学基金（30860001）

张亚平（1964-），女，教授，硕士生导师，研究方向为环境微生物。E-mail:xhsl-001@163.com。

时间2014-4-21 13:26:37[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1326.042.html

张亚平,曹小妮,路盼盼,等.新疆泥火山群土壤真菌群落的DGGE分析[J].东北农业大学学报,2014,45(4)∶66-70.

Zhang yaping,Cao Xiaoni,Lu Panpan,et al.Analysis of the fungi communities in mud volcano soils in Xinjiang using DGGE [J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶66-70.(in Chinese with English abstract)