SND1对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

高学军，司雨，张霞，黄玉玲，曲波，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

SND1对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

高学军，司雨，张霞，黄玉玲，曲波，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

SND1（p100）作为转录共激活子，在信号转导和转录激活因子5（STAT5）中起重要作用，已在牛以外的其他物种中报道SND1与STAT5相互作用激活STAT5基因介导基因转录。试验为验证SND1对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期影响，构建SND1表达载体及si RNA转染奶牛乳腺上皮细胞，用CASY法检测细胞活力及增殖能力，用流式细胞仪检测奶牛乳腺上皮细胞周期，Western Blot确定SND1转染奶牛乳腺上皮细胞功能。结果表明，SND1对于奶牛乳腺上皮细胞增殖属于正调控因子，SND1与STAT5相互作用影响CyclinD1表达，SND1通过CyclinD1途径促进细胞周期进行。

SND1；奶牛乳腺上皮细胞；过表达；RNA干扰；细胞增殖

SND1最初作为EBNA2（Epstein-Barr virus nu⁃clear protein 2，EB病毒细胞核抗原2）转录共激活因子蛋白被发现[1]。SND1（Tudor-SN，p100）是一种进化上高度保守且分布广泛的蛋白质，已发现其在人、牛、大鼠、小鼠、嗜热四膜虫、水稻、拟南芥等不同物种中均广泛存在。SND1是多功能蛋白，可以与转录相互作用并广泛调节涉及转录的蛋白质，例如EBNA-2活化基因表达的转录[2]。除结合EBNA-2的酸性激活域，曾有报道证实SND1蛋白可作为转录共激活因子与STAT5-TAD区域结合，参与调控JAK2-STAT5信号通路[3]。JAK-STAT信号通路是近年发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要生物学过程[4]。研究发现在小鼠细胞内干扰SND1蛋白表达，抑制细胞的增殖能力，使细胞周期停滞于Gl期，超表达SND1蛋白却发现其能加快细胞周期进程，表明SND1蛋白参与细胞周期调控过程，并在Gl期发挥重要作用[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系[6]。

1.1.2 主要试剂

胰岛素、催乳素（购自Sigma公司）；优质胎牛血清、DF12培养基（购自Gibco公司）；STAT5、p-STAT5、β-actin一抗（购自Santa Cruz公司）；SND1（购自Abcam公司）；HRP标记山羊抗兔IgG二抗、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗（购自北京中杉公司）；ECL超敏发光液（购自普利莱生物公司）；根据SND1基因序列设计合成的siRNA oligos、阴性对照siRNA（购自上海吉玛公司）；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol试剂（购自Invitrogen公司）；CASY-ton缓冲液其他常规药品和试剂均为国产。

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱（日本CO-150型），DFC280倒置相差显微镜（德国LEICA），ABI PRISM 7300 RTPCR系统（美国Applied Biosystems公司），流式细胞仪（美国Becton Dicknson公司），CASY细胞活力分析仪（德国Roche公司）；其他仪器均为国产。

1.2 方法

1.2.1 RNA干扰转染

选择对数生长期的荷斯坦牛乳腺上皮细胞，传代到6孔培养板中增长过夜，待转染的各孔细胞中，分别加入1 μg DNA和2 μL脂质体2000（LF2000）稀释到200 mL无血清培养基中，脂质体2000一旦稀释与DNA在室温下孵育20 min，使形成的DNA-LF2000络合物，然后直接加入到各孔中。细胞在37℃下培养24 h，然后收集用于进一步的试验。

1.2.2 pGCMV-IRES-EGFP-SND1构建和转染

SND1全长片段通过PCR扩增，并与特定的限制性内切酶位点结合而设计的引物如下。上游引物：5′GAAGATCTATGGCCTCCTCCGCGCAGAGC 3′（BglⅡ），下游引物：5′GCGTCGACTGGAAGGAG AGGGCAGGTC3′（Sal I）。PCR片段连接到TA克隆载体（Promega公司）并完全测序，全长的SND1由Bgl II和Sal I剪切，然后连接到pGCMV-IRESEGFP载体。所有结构进行测序验证。待转染的各孔细胞中，分别加入1 μg DNA和2.5 μL脂质体2000（LF2000）稀释到200 mL无血清培养基中，脂质体2000一旦稀释与DNA在室温下孵育20 min，使形成的DNA-LF2000络合物，然后直接加入到各孔中。细胞在37℃下培养24 h，然后收集用于进一步的试验。

1.2.3 细胞活力及增殖能力的检测

利用胰蛋白酶消化各组细胞，制成单细胞悬液，取100 μL加入到10 mL CASY-ton缓冲液中稀释摇匀，取200 μL进行检测，做3次平行，采用CASY细胞活力分析仪测定细胞活力和增殖能力。

1.2.4 细胞周期的测定

取转染24 h后6孔板中的细胞，消化成单细胞悬液，用PBS洗涤800 r·min-1离心5～10 min，用预冷的70%酒精与PBS按7:3的比例固定过夜，PBS再洗涤800 r·min-1离心5～10 min，加PI染料50 μg·mL-1，待上机测定。

1.2.5 Western blotting分析

用细胞裂解液提取转染24 h的细胞总蛋白。β-actin作为内参，Western Blotting条件：10% SDS-PAGE，一抗比例1∶1 000，二抗比例1∶5 000稀释，每个试验重复3次。

1.2.6 数据统计与分析

应用SPSS 13.0进行数据统计和分析，所有结果均用平均值±标准误表示，所有试验重复3次。P＜0.05为统计学差异显著，P＜0.01为差异极其显著。

2 结果与分析

2.1 转染siRNA及表达载体对细胞增殖及周期分布的影响

通过RNA干扰技术和质粒转染技术实现SND1的抑制和过表达后，采用CASY法检测不同组间奶牛乳腺上皮细胞的增殖情况。奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期分布如图1所示，转染siRNA对奶牛乳腺上皮细胞的活力及增殖能力具有抑制作用（见图1A、1B）；转染pGCMV-IRES-EGFP-SND1对奶牛乳腺上皮细胞的活力及增殖能力具有促进作用（见图1C、1D）。通过流式细胞仪检测不同组间奶牛乳腺上皮细胞的周期分布情况，观察SND1对细胞周期分布的影响。试验结果如图1E所示，转染siRNA下调SND1的表达水平时，G1期细胞比例增加，S期和M期细胞比例降低，细胞增殖指数显著降低；转染pGCMV-IRES-EGFP-SND1质粒上调SND1表达水平时，Gl期细胞比例降低，而S期和M期细胞比例增加，细胞增殖指数显著升高（见图1F）。

图1 奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期分布Fig.1 Dairy cow mammary epithelial cells proliferation and cell cycle distribution

2.2 干扰SND1下调增殖相关蛋白的表达

转染siRNA抑制SND1的表达，在乳腺上皮细胞中用Western blotting检测相关增殖基因表达。与对照组比较，SND1抑制组SND1蛋白表达明显下降（50%～55%）。在乳腺上皮细胞增殖中，CyclinD1是关键因子。Western blotting结果显示，CyclinD1的表达水平降低。与对照组比较，SND1抑制组STAT5，p-STAT5蛋白表达水平都有明显的降低。

2.3 过表达SND1上调增殖相关蛋白的表达

为验证SND1影响增殖相关基因的表达，过表达SND1时，在乳腺上皮细胞中用Western blotting检测增殖相关蛋白的表达。Western blotting结果显示，SND1增加CyclinD1蛋白的表达，SND1上调STAT5，p-STAT5蛋白表达，这些数据表明SND1可能通过p-STAT5和CyclinD1调控乳腺上皮细胞增殖（见图3）。

图2 干扰SND1抑制增殖相关蛋白Western blotting结果（A）及蛋白表达灰度扫描值（B）Fig.2 Interference SND1 inhibit proliferation related proteins Western blotting results（A）and protein expression gray scanning value（B）

图3 过表达SND1上调增殖相关蛋白Western blotting结果（A）及蛋白表达灰度扫描值（B）Fig.3 Overexpression of SND1 increase proliferation related proteins Western blotting results（A）and protein expression gray scanning value（B）

3 讨论与结论

SND1在哺乳动物细胞中有多种生物作用，包括转录，mRNA加工，mRNA剪接，RNAi诱导沉默复合物（RISC）形成等[7]。本试验SND1过表达和干扰影响CyclinD1和p-STAT5表达。STAT5能够影响细胞的增殖、分化、存活与凋亡，在乳腺发育、免疫应答、干细胞自我更新调控、造血作用以及肿瘤的发生发展等中具有重要作用[8]。SND1作为转录共激活因子与其他转录因子相互作用，包括STAT5，STAT6，c-Myb，Pim-1。STAT5在细胞质中是无活性物质，磷酸化使其激活，在乳腺中STAT5参与细胞增殖[9]。本文证明在乳腺上皮细胞中SND1参与PRL-Jak2-Stat5途径调控细胞增殖。SND1增加STAT5和p-STAT5的表达，说明SND1可能与STAT5相互作用调控细胞增殖。

流式结果研究发现，在乳腺上皮细胞内干扰SND1蛋白表达，抑制细胞的增殖能力，使细胞周期停滞于G1期，细胞增殖指数显著降低；超表达SND1蛋白却发现其能够加快细胞周期进程，表明SND1蛋白参与细胞周期调控过程，并在G1期发挥重要作用，细胞增殖指数显著升高。这与之前报道小鼠细胞内研究结果一致[5-10]。STAT5激活反应也直接和间接调节调控细胞周期的CyclinD1蛋白的表达[11]。SND1控制细胞周期的进程由G1向S期转变。CyclinD1是由G1向S期转变的重要调节因子[12]。Western Blotting结果证实，在SND1过表达组，CyclinD1蛋白表达明显增长。而SND1抑制组中CyclinD1蛋白表达显著减少，SND1与STAT5相互作用影响CyclinD1表达。可能存在一个机制是在乳腺上皮细胞中，SND1可能会影响细胞周期进程通过CyclinD1激活。目前有关SND1蛋白报道较多[10-12]，大多是人类肿瘤、癌症等方面的研究，对于奶牛乳腺方面研究较少，局限在SND1作为转录共激活子调节基因表达等方面，本文对SND1促进奶牛乳腺上皮的细胞增殖并促进细胞周期进程有新见解。

SND1增加STAT5、p-STAT5和CyclinD1表达。SND1与STAT5相互作用影响CyclinD1表达，SND1促进乳腺上皮细胞的增殖通过刺激CyclinD1表达。

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SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cellsin vitro

GAO Xuejun,SI Yu,ZHANG Xia,HUANG Yuling,QU Bo,LI Qingzhang
(Key Laboratory of Dairy Science of Education Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

SND1(p100)as a co-activator for several transcription factors，plays a vital role in signal transduction and activator of transcription 5(STAT5)，there are reports that SND1 interaction with STAT5 mediates gene transcription.In this study,in order to verify SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cells(DCMEC),we constructed transfected DCMEC with SND1,the viability and proliferation of DCMEC were measured by CASY method,DCMEC were detected by flow cytometry method.Western blot was used to determine SND1 transfection into DCMEC function.These data demonstrated that SND1 was a positive regulatory factor of DCMEC on proliferation ability,and SND1 interacted with STAT5 which impacted CyclinD1 expression.SND1 could promote cell cycle by CyclinD1 pathway.

SND1;dairy cow mammary epithelial cell;overexpression;RNA interference;cell proliferation

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）04-0078-05

2013-11-12

科技部“973”项目（2011CB100804）；科技部“863”项目（2013AA102504-03）

高学军（1969-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为泌乳生物学与乳业生物技术。E-mail:gaoxj5390@sina.com

时间2014-4-21 13:22:12[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1322.010.html

高学军,司雨,张霞,等.SND1对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响[J].东北农业大学学报,2014,45(4)∶78-82.

Gao Xuejun,Si Yu,Zhang Xia,et al.SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cellsin vitro[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶78-82.(in Chinese with English abstract)