乳链菌肿瘤特异性标记载体的构建及初步验证

陈雅莹 陈科全 陈学清

乳链菌肿瘤特异性标记载体的构建及初步验证

陈雅莹 陈科全 陈学清

目的利用乳链菌穿梭载体构建肿瘤特异标记表达系统，为肿瘤特异性口服疫苗的研究开辟一个新领域。方法采用体外基因拼装的方法得到PEG-3启动子，经酶切鉴定并测序验证。然后利用基因克隆技术，将PEG-3启动子、EGFP、Poly A亚克隆到乳链菌载体pTRKH2中，成功得到肿瘤特异标记质粒pTR-peg3-egfp。最后，转染肿瘤及非肿瘤细胞初步验证其肿瘤特异性标记能力。结果通过PCR基因拼装得到460bp左右目的片段，测序结果与设计完全一致。获得了肿瘤特异标记的乳链菌穿梭质粒pTR-peg3-egfp，并在细胞水平得到初步验证。结论PEG-3启动子介导的乳链菌穿梭质粒具有肿瘤特异性，这一实用新颖的系统将为研究乳链菌疫苗应用于肿瘤标记及靶向治疗奠定基础。

PEG-3启动子；乳链菌；基因治疗；肿瘤

恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一，随着肿瘤发生发展分子机理研究的深入，学者们着手从基因水平进行治疗。表达靶向性差和表达效率低是限制基因治疗进一步应用的主要障碍。因此，构建高效的靶向性载体具有重要意义。自从Emdad等[1]发现的PEG-3（progression elevated gene-3）启动子能特异性识别多种恶性肿瘤细胞，而不对正常细胞产生影响之后，国内外开展了许多关于PEG-3的研究，表明在前列腺癌[2]，乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、恶性胶质瘤[5]、神经母细胞瘤[6]、黑色素瘤[7]、肾癌[8]、肝癌[9]等恶性肿瘤均有靶向作用。PEG-3作为理想的肿瘤特异性启动子为肿瘤的诊断及基因治疗提供了新思路。目前，国内外关于PEG-3介导外源性基因表达的研究大多采用病毒载体，具有潜在危险性。乳链菌（Streptococcus lactis;Lactococcus lactis）作为一种安全有效的非病毒载体，被大量用于表达多种生物多肽或蛋白及口服疫苗的研究。我们拟利用乳链菌穿梭载体构建肿瘤特异性标记系统，为将来乳链菌疫苗应用于肿瘤的标记及靶向治疗奠定基础。

材料和方法

一、材料

1.生物材料

大肠杆菌DH5a感受态、PMD20-T载体购自Takara生物公司；pEGFP-C2质粒由本实验室保存；质粒pTRKH2由美国Klaenhammer TR教授惠赠。

2.质粒和试剂

Taq 2×PCR mix、DNA Ladder为东盛生物公司产品；高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase及所用限制性内切酶为Takara生物公司产品，T4连接酶购自NEB公司；转染试剂Lipofectamin LTX &Plus购自invitrogen公司；质粒提取试剂盒及PCR凝胶回收试验盒为Axygen公司产品。寡核苷酸引物及测序于生工生物有限公司进行。其它试剂均为国产化学分析纯。

二、方法

1.体外拼装peg-3启动子

Internet在线进入DNAWORKS程序，将PEG-3碱基序列输入，该程序自动将目的基因序列设计成18条相互重叠的cDNA寡核苷酸片段（P1-P18）。拼装引物设计、PCR反应参照文献的方法[10]。取上述拼接产物加A尾后用PMD20-T试剂盒进行TA克隆。方法按takara公司提供的说明书进行。PEG-3阳性克隆产物经酶切鉴定后送生工生物公司测序。

2.载体pTR-peg3-egfp的构建

首先以pEGFP-C2为模板，设计特异性引物把EGFP、Poly A进行TA克隆。经测序验证无误后将EGFP、Poly A片段亚克隆至乳链菌穿梭质粒pTRKH2上。最后将PEG-3阳性克隆产物及上述含有EGFP、Poly A的pTRKH2质粒分别加入Xba I和SacI进行双酶切，切胶回收后进行连接，16℃过夜。大肠杆菌DH5a感受态细胞，加入10 μL连接产物，冰上放置30 min，42℃热休克90 s，然后迅速置于冰上3 min，加入800 μL LB液体培养基，37℃摇床温和摇振（220 r/rain）1 h复苏细菌，吸取200 μL菌液用铺菌棒均匀涂布于含红霉素（终浓度150 μg/ mL）的LB平板上，37℃倒置培养16 h。分别挑取LB平板上生长的数个单菌落，加入至含红霉素的5 mL LB液体培养基37℃220 r/min摇振16 h，提取质粒，酶切鉴定，并命名为pTR-peg3-egfp（见图1）。

3.pTR-peg3-egfp质粒肿瘤特异性的初步验证

以肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L02为代表进行初步验证。HepG2、L02细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5%CO2恒温培养箱培养。转染前一天将HepG2和L02细胞按1× 104/孔种于24孔板中，用无抗生素的培养液培养24 h后，换无血清培养液，用脂质体（Lipofectamin LTX &Plus）转染，方法按产品说明书进行。pTR-peg3-egfp质粒及pEGFP-C2质粒分别转染HepG2、L02细胞，每孔加入质粒DNAlug，均各做3个复孔。转染6h后换掉转染培养液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。24 h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

图1 肿瘤特异性乳链菌载体构建示意图。PEG-3：肿瘤特异性启动子；egfp：增强型绿色荧光蛋白；polyA:多聚腺苷酸加尾信号。

结果

一、PEG-3启动子拼装

将第1次PCR反应产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，发现有460 bp左右的DNA目的片段，但目的DNA片段后有拖尾状的其它非目的片段产生；产物稀释100倍后，再用第1和第16条引物，以同样条件进行PCR反应，形成一条明显的目的条带（见图2），目的片段大小与设计的预期片段相符合。PEG-3启动子TA克隆产物经酶切鉴定后送生工生物公司测序与原设计序列完全相符。

PEG-3测序结果：下划线为酶切位点Xba I和SacI。

tctagaggatctactagtcatatggattgggtaccgggccccccgtcgacct gatgaagttggcgtgcttgctcaaaagttctgcgagattgacggctctctgg atttgagccaaggacacgcctgggaagccacggtgacctcacaaggccc ggaatctccgcgagaatttcagtgttgttttcctctctccacctttctcagggac ttccgaaactccgcctctccggtgacgtcagcatagcgctgcgtcagactataaactcccgggtgatcgtgttggcgcagattgactcagttcgcagcttgtgg aagattacatgcgagaccccgcgcgactccgcatccctttgccgggacag cctttgcgacagcccgtgagacatcacgtccccgagccccacgcctgagg gcgacatgaacgcgctggccttgagagcaatccggacccacgatcgctttt ggcaaaccgaaccggacaagcttaatcggatccccgggtaccgagctc

二、载体pTR-peg3-egfp酶切鉴定结果

整个载体上共有三个EcorⅠ位点，在载体多克隆位点的前后各有一EcorⅠ故能把我们的插入片段都切下来，载体复制子P15A ori前亦有一EcorⅠ，故pTR-peg3-egfp经EcorⅠ酶切可形成三条带（见图3），其中略大于1500bp的条带为整个多克隆位点（含插入片段PEG-3、egfp、poly A）。证实载体pTR-peg3-egfp构建成功。

图2 PEG-3第2次PCR扩增后电泳图（泳道1为takara公司DL2000marker）

图3 质粒pTR-peg3-egfp酶切鉴定图（泳道1为takara公司DL5000marker）

三、质粒pTR-peg3-egfp的转染结果

以肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L02为代表进行初步验证。CMV启动子没有肿瘤特异性，具有CMV启动子的pEGFP-C2质粒转染HepG2和L02细胞均能表达荧光；PEG-3启动子有肿瘤特异性，用pTR-peg3-egfp质粒转染肝癌细胞HepG2表达荧光，转染正常肝细胞L02没有表达荧光（见图4）。

讨论

肿瘤基因治疗当前的重点在于建立靶向性好和表达效率高的载体系统。肿瘤特异性启动子可驱动目的基因实现肿瘤的靶向治疗。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）启动子、mucin-1启动子、CEA（carcinoembryonic antigen）等肿瘤特异性启动子只针对有限组织起源的肿瘤细胞，且转录活性较弱，因而运用受到了限制。针对广泛肿瘤特征的PEG-3启动子能特异性识别多种恶性肿瘤细胞，而不对正常细胞产生影响，具有很好的靶向性。PEG-3启动子可直接影响肿瘤细胞所特有的转录因子，表达水平高，无需添加二步放大系统，活性与组成性激活SV40启动子相当[11]。因此PEG-3无疑是应用于基因诊断、转移监测乃至基因治疗最有前景的肿瘤特异性启动子。

图4 质粒pTR-peg3-egfp的转染结果（A、B分别为明场及荧光场下pEGFP-C2质粒转染L02细胞表现；C、D分别为明场及荧光场下pTR-peg3-egfp质粒转染L02细胞表现；E、F分别为明场及荧光场下pEGFP-C2质粒转染HepG2细胞表现；G、H分别为明场及荧光场下pTR-peg3-egfp质粒转染HepG2细胞表现）

国内外关于PEG-3介导外源性基因表达的研究大多采用病毒载体。虽然这种方法能使基因高水平导入和表达，但所引发的宿主炎性免疫反应较强，生产成本亦甚高，最重要的是其可能通过重组产生致病的野生型病毒具有潜在危险性。其实，研究人员很早就建立了多种由细菌介导外源性质粒DNA进入哺乳动物细胞的方法[12]，有人称之为Bactofec－tion[13]（“菌感”）。乳链菌是一种对人体无害，安全的细菌（generally regarded as safe,GRAS），被广泛应用于乳制品工业、生物多肽或蛋白及口服疫苗的研究[14]。这一食品级细菌无疑是作为“菌感”菌的最佳选择。本实验成功构建了PEG-3启动子驱动的乳链菌穿梭载体，并验证了其肿瘤靶向标记能力，为进一步研究乳链菌疫苗应用于肿瘤标记及靶向治疗奠定基础。

1Emdad L,Sarkar D,Su ZZ,et al.Progression elevated gene‐3 (PEG‐3)induces pleiotropic effects on tumor progression:Modulation of genomic stability and invasion.J Cell Physiol,2005,202(1): 135-146.

2Sarkar D,Lebedeva IV,Su Z,et al.Eradication of therapy-resistant human prostate tumors using a cancer terminator virus.Cancer Res, 2007,67(11):5434-5442.

3Sarkar D,Su Z,Vozhilla N,et al.Dual cancer-specific targeting strategy cures primary and distant breast carcinomas in nude mice. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(39):14034-14039.

4Chan I,Lebedeva I V,Su ZZ,et al.Progression elevated gene‐3 promoter(PEG‐Prom)confers cancer cell selectivity to human polynucleotide phosphorylase(hPNPaseold‐35)‐mediated growth suppression.J Cell Physiol,2008,215(2):401-409.

5Hamed H A,Yacoub A,Park M A,et al.Histone Deacetylase Inhibitors Interact with Melanoma Differentiation Associated-7/Interleukin-24 to Kill Primary Human Glioblastoma Cells.Mol Pharmacol,2013,84(2):171-181.

6Van Maerken T,Sarkar D,Speleman F,et al.Adenovirus‐mediated hPNPaseold‐35 gene transfer as a therapeutic strategy for neuroblastoma.J Cell Physiol,2009,219(3):707-715.

7Sarkar D,Su ZZ,Park ES,et al.A cancer terminator virus eradicates both primary and distant human melanomas.Cancer Gene Ther, 2008,15(5):293-302.

8Hamed HA,Das SK,Sokhi UK,et al.Combining histone deacetylase inhibitors with MDA-7/IL-24 enhances killing of renal carcinoma cells.Cancer Biol Ther,2013,14(11):1039-1049.

9Zhang J,Gan Y,Gu J,et al.Potent anti-hepatoma efficacy of HCCS1 via dual tumor-targeting gene-virotherapy strategy.Oncol Rep,2008,20(5):1035-1040.

10陈学清,王亚东,孙勇,等.体外拼装凋亡素基因.第一军医大学学报,2005,25(2):195-197.

11 Hyo-eun CB,Gabrielson KL,Laterra J,et al.Tumor-specific imaging through progression elevated gene-3 promoter-driven gene expression.Nat Med,2011,17(1):123-129.

12 Grillot-Courvalin C,Goussard S,Huetz F,et al.Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells.Nat Biotechnol,1998,16(9):862-866.

13 Akin D,Sturgis J,Ragheb K,et al.Bacteria-mediated delivery of nanoparticles and cargo into cells.Nat Nanotechnol,2007,2(7):441-449.

14 Ravnikar M,譒trukelj B,Obermajer N,et al.Engineered lactic acid bacterium Lactococcus lactis capable of binding antibodies and tumor necrosis factor alpha.Appl Environ Microbiol,2010,76(20): 6928-6932.

Construction and identification of the tumor-specific imaging system with the recombinant lactococcus lacti shuttle vector

CHEN Ya-ying,CHEN Ke-quan,CHEN Xue-qing.Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,No.151,Yanjiang Road,Guangzhou 510120, Guangdong,China

Objective The aim of this study is to construct a tumor-specific imaging system with the shuttle vector of lactococcus lacti which will open a new field for the study of tumor-specific oral vaccine. Methods The PEG-3 promoter was constructed by means of PCR base gene assembly,and conformed by enzyme digestion and DNA sequencing.Then,constructed recombinant pTR-peg3-egfp(shuttle plasmid)carrying the PEG-3 promoter enhanced green fluorescent protein and Poly A tail.Finally,the ability of tumor-specific imaging in the means of in vitro transfection was validated.Results A 460 bp purpose fragment obtained by PCR gene splicing agreed exactly with the design.The tumor specific lactococcus lacti plasmid pTR-peg3-egfp was successfully constructed,and also got a preliminary validation on cellular level.Conclusion Lactococcus lacti vector with PEG-3 promoter could specifically recognize tumor cell.This utility,new lactococcus lacti system can lay a solid foundation for both cancer imaging and tumor-specific gene therapy.

PEG-3 promoter;Lactococcus lacti;Gene therapy;Neoplasms

2014-01-21）

（本文编辑：白杨）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.002

510120广州医学大学附属第一医院消化内科

陈学清，E-mail：chenxq@vip.163.corn

国家自然科学基金项目（No：81250012）