甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

邹游兴，刘向蕊，王洪星

（海南大学应用科技学院，儋州571737）

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

邹游兴，刘向蕊，王洪星

（海南大学应用科技学院，儋州571737）

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物，应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的DNA片段。以pET32a（+）为原核表达载体，构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后，将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）pLySs，在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示，在该表达系统中，融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在；P0融合蛋白大小约45 kDa，与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符，用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白，免疫家兔制备出抗血清，通过酶联法（ID-ELISA）测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。

甘蔗黄叶病毒；沉默抑制子；原核表达；抗血清

甘蔗是禾本科（Graminaceae）甘蔗属（Saccharum L.）植物，是重要的热带、亚热带经济作物，是许多国家和地区主要的糖料来源。甘蔗属于无性繁殖作物，病毒的累积使病害逐年加重[1]。甘蔗黄叶病（Sugarcane yellow leaf disase，SCYLD）又称甘蔗黄叶综合症（Sugarcane yellow leaf syndrome，SCYLS）。1990年Schenck等人第一次报道了这种大面积出现于夏威夷群岛夷哈马库亚（Hamakua）地区种植的H65-7025甘蔗品种上的非营养缺乏性甘蔗黄化现象[2-3]。甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）引起的甘蔗黄叶病亦称黄叶综合症是我国和世界甘蔗生产中最主要的病害之一，造成产量下降、品质变劣和品种种性退化[4]。本实验根据GenBank查找到的甘蔗黄叶病毒P0基因序列设计引物，连接到载体并进行原核表达和高效价特异性抗血清制备。一方面我们可以利用获得的表达蛋白制备多克隆抗血清，用于SCYLS的检测；另一方面，也可将这些表达蛋白用于与之具有相互作用的宿主蛋白的体外筛选，为后期着手研究甘蔗黄叶病毒与寄主之间互作做一定的前期工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病样取甘蔗植株病征叶片，包装编号后保存于本实验室-80℃冰箱中备用。

1.1.2 菌株与质粒克隆载体pMD 19-Tsimple vector购自大连宝生物公司（TaKaRa）；表达载体pET-32a由本实验室保存；克隆菌株E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；表达菌株E.coli BL21（DE3）购自德国默克公司。

1.1.3 酶和化学试剂Trizol Reagent、琼脂糖凝胶回收Kit、质粒小提Kit和DNA Marker购自北京天根生物技术公司；M-MLV RT RnaseH、Rnase Inhibitor、ExTaq酶及Primer STARTM HS DNA Polymerase、rTaq DNA Polymerase、氨苄青霉素（Ampicillin）、限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ、IPTG均购自大连宝生物公司；蛋白低分子量Marker购自Promega公司；丙烯酰胺、N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Solarbio公司；十二烷基磺酸钠（SDS）、考马斯亮蓝R-250购自Amresco公司；其它化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗叶片总RNA的提取与cDNA的合成按照TianGen公司Kit说明，用Trizol从严重感染甘蔗黄叶病毒的甘蔗叶片中提取总RNA。称取0.5 g叶片，放入加有液氮的研钵（用无水乙醇灼烧处理30 min灭活RNase）中研磨，研磨充分后转入加有1 mL Trizol的1.5 mL离心管中，使之成为组织悬液，用氯仿抽提后加入等体积的异丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗涤两次，溶于适量的RNase-free水中，测定OD260/OD280值并确定总RNA的含量和纯度。

按TaKaRa公司cDNA Kit说明书进行cDNA的合成：取1μg总RNA，1 μL Oligo（dT）15.4 μL 5×RT Buffer，2 μL dNTP Mixture，1 μL RNase Inhibitor，逆转录酶1 μL，加RNase-free水至总体积为20 μL，混匀，稍离心。30℃水浴10 min，42℃保温60 min，75℃灭活10 min，4℃冷却5 min，-20℃保存备用。

1.2.2 甘蔗黄叶病毒基因P0的克隆根据本实验室获得的甘蔗黄叶病毒基因序列设计引物对ScYLV P0-F/ScYLV P0-R（Invitrogen公司合成）进行PCR扩增，引物序列如下：

ScYLVP0-F:5＇-CGGGATCCATGCTTTTCAACGAATT-3＇BamH I

ScYLVP0-R:5＇-CCCAAGCTTCTATATATCATGAGAATAGGT-3＇Hind III

PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环35次；72℃终止补偿延伸10 min。

取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL Goldview）1×TAE缓冲体系中电泳，Maker为DL2000（TaKaRa公司），剩余PCR扩增产物回收并纯化目的片段。PCR产物纯化采用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物技术有限公司），具体操作过程参照试剂说明书进行。回收PCR产物用T-A克隆方法克隆到质粒pMD 19-Tsimple vector（TaKaRa公司）中，转化到大肠杆菌DH5α。

以菌液为模板进行PCR法鉴定重组质粒（引物同前）。阳性质粒抽提后进行双酶切（BamHⅠ/HindⅢ）鉴定阳性重组子。经上述两种方法鉴定后，阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序，获得目的重组克隆质粒pMD 19T-P0。

1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定用BamHⅠ/HindⅢ双酶切重组克隆质粒pMD 19T-P0和表达载体pET32a(+)。经琼脂糖凝胶电泳，回收P0和pET32a(+)片段；P0片段与pET32a(+)片段在T4DNA连接酶的作用下，16℃水浴连接过夜。连接产物转化到大肠菌BL21（DE3）感受态细胞。经菌液PCR鉴定获得的阳性克隆后，再用小量法抽提重组表达质粒。重组质粒经BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定后进行测序。测序正确的阳性重组子命名为pET32a(+)-P0。

1.2.4 融合蛋白的诱导表达和可溶性分析以1∶100的接种量，将转化进重组子pET32a（+）-P0的大肠杆菌（BL 21）接种于50 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）中，37℃摇床振荡培养。OD600值达到0.5～0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，转到30℃继续培养3～6 h。

取1 mL诱导表达的菌液加入2 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用50 μL双蒸水悬浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4℃条件下，12 000 r/min离心1 min，取上清10 μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝—250 R染色，分析融合蛋白的表达情况。收集经诱导培养4 h的菌液样品，采用超声波破碎菌体细胞，离心后分别取1 mL上清液和沉淀按上述方法进行SDS-PAGE电泳，对融合蛋白进行可溶性分析。

1.2.5 融合蛋白的纯化扩大培养重组表达菌1 L，按上述条件诱导表达4 h。4℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀。沉淀重悬于Resnsptnsion buffer溶液，超声波破碎10 min，4℃12000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀重悬于Isolation buffer溶液，超声波破碎10 min，4℃12000 r/min离心10 min；重复1次上一步骤；弃上清，最后包涵体重悬于含6M尿素的Binding buffer溶液中，RT 30～60 min。将制备好的溶液过Ni2+-NTA亲和层析柱，经Washing buffer（含50 mM咪唑）溶液洗去杂蛋白，再经咪唑终浓度为500 mM的Elution buffer溶液洗脱，最终融合蛋白溶于其中，12%SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白纯化程度。

1.2.6 抗血清制备及血清学检测纯化的融合蛋白溶液经过透析袋透析获得溶于1×PBS的蛋白溶液。BCA法测定其浓度，与佐剂（1∶1）混匀，采用皮下多点注射抗原的方法免疫2只白兔[5]，每只总注射量为1.5～2.0 mg。第三次免疫10d后，每只白兔耳缘静脉取血0.5～1.0 mL，分离抗血清。以1×PBS的蛋白溶液作抗原，IDELISA检测抗血清效价，血清效价未符合要求则继续免疫。血清效价符合要求后，心脏采血，分离抗血清，以融合蛋白作为抗原测定抗血清效价。

2 结果

图1 PCR扩增结果

图2 重组质粒pET32a-P0酶切鉴定

2.1 ScYLV-P0基因克隆和表达质粒的构建

用PCR方法从病样总DNA中扩增获得的ScYLV-P0基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后结果见图1。以照片左侧分子量标记为对照，扩增片段大小约为771 bp，而健康植株和双蒸水的阴性对照均未出现特异性扩增条带。表达重组质粒pET32a-P0经BamHⅠ/HindⅢ双酶切验证，出现特异性DNA条带，其大小约为771 bp（图2），从而进一步证明已成功构建了重组表达质粒pET32a-P0。

2.2 AcPmp基因的诱导表达及可溶性分析

在30℃，IPTG终浓度0.1 mmol/mL条件下，诱导表达pET32a-P0重组表达菌[E.coli BL21（DE3）]。取1 mL菌液样品进行SDS-PAGE电泳分析（如图3）显示：在约43kDa处有一明显区别的条带，其大小与预估的融合蛋白大小符合。剩余菌液经细胞破碎仪破碎细胞后，分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳分析（如图4）。结果显示：在此条件下诱导表达获得的目的融合蛋白为包涵体蛋白。

图3 融合蛋白Ac-PM的SDS-PAGE分析

图4 P0融合蛋白可溶性分析

2.3 抗血清的制备和效价测定

在注射抗原蛋白到白兔前，用ID-ELISA对白兔进行免疫前血清本底水平检测，结果显示：实验所选用的两只大白兔（大白兔A和大白兔B）血清本底比较低，符合实验要求（表1）。将纯化获得的融合蛋白作为免疫原，第一次与完全佐剂等比例混匀，第二、三次与不完全佐剂等比例混匀，采用肌肉与皮下注射相结合免疫大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液为抗原进行ID-ELISA测定抗血清效价。测得该抗血清的效价为1∶25000（表2）。

表1 ID-ELISA检测免疫前血清本底水平（OD值）

表2 不同稀释度抗血清与蛋白的ID-ELISA结果的OD值

3 讨论

利用原核表达系统表达外源蛋白来获得抗原已经成为一项成熟的实验技术。表达的外源蛋白有两种形式，一种是可溶性的外源融合蛋白，一种是以包涵体形式存在的融合蛋白。在对两种形式的蛋白进一步纯化时，主要区别在于包涵体需要经过变复性处理，而可溶性蛋白则不需要[6]。

本研究获得了甘蔗黄叶病毒P0基因序列。用原核表达载体表达P0基因的全长蛋白，从而用pET32a（+）原核表达载体成功构建了P0基因表达质粒。但在诱导表达中，表达量并不是很高，并且可溶性蛋白含量相对较少，包涵体形式存在的蛋白占有不少的比例。本实验在低温条件下诱导表达，多次诱导表达，将获得的可溶性融合蛋白收集进行纯化，获得大量可溶性蛋白，制备了专化性很强的抗血清，制备的SCYLV抗血清经ELISA检测，证实其具备较高的血清效价（1∶25000）和较好的特异性。为今后研发高效准确的SCYLV血清学检测试剂盒提供了实验基础，为甘蔗黄化病的快速检测提供了一条较为便捷的途径。

[1]周国辉，许东林，蔡艳清，等.我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定[J].广西农业生物科学，2006，25（3）：226-228

[2]Schenck S.Yellow leaf syndrome-A new sugarcane disease[R].Exp.Sta.Hawaiian Sugar Planter's Assoc.,Annual Report,1990:38

[3]Schenck S,Hu J S and Lockhart B E L.Use of a tissue blot immunoassay to determine the distribution of sugarcane yellow leaf virus in Hawaii[J].Sugar Cane,1997,4:5-8.

[4]Grisham，M.P.，Johnson R M.，Zimba P v.Detecting sugarcane yellow leaf virus infection in asymptomatic leaves with hyperspectral remote sensing and associated leaf pigment changes[J].J Virol.Methods，2010,167(2):140-145.

[5]余乃通，冯团诚，王健华，等.香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备[J].热带作物学报，2010，31（5）：767-771.

[6]张婷婷，叶波平.包涵体蛋白质的复性研究进展[J].药物生物技术，2007，14（4）：306-309.

Cloning and Prokaryotic Expression of Sugarcane Yellow Leaf Virus P0 Gene and Preparation of Antiserum

ZOU You-xing,LIU Xiang-rui,WANG Hong-xing
(College of Applied Science and Technology,Hainan University,Danzhou 571737,China)

A specific primers used in RT-PCR were designed according to the sequences of SCYLV-P0 gene published.A target fragment of P0 was isolated by RT-PCR with RNA isolated from diseased leaves as template. The complete SCYLV-P0 gene was taken according to the sequence analysis.The plasmid of pET32a(+)was taken as vector bone，and the prokaryo expression plasmids named as pET32a-P0 with the target gene of P0 was constructed.The recombinant plasmids pET32a-P0 were tested by double digestion tests and sequncing,then they were transformed into competent cells of E.coli BL21(DE3)pLySs and induced by IPTG to express the target gene.The P0 fusion protein was expressed as inclusion body,the molecular weight of P0 fusion protein was about 45 kDa with two parts of 29.991 kDa according to P0 and 18 kDa according to pET32a(+).The fusion protein was then purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography,and used to immune rabbits for antiserum preparation.The optimal titer of the antiserum was determined to be as 1:25000 by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ID-ELISA).

sugarcane yellow leaf virus;RNA silencing suppressor;prokaryotic expression;antiserum

435.661

A

1007-2624（2014）02-0001-03

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.001

2013-09-04

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（ITBB110303）；现代农业产业技术体系建设专项资金（nycytx-24）。

邹游兴（1986-），男，福建省建瓯市人，硕士，助教，主要从事农作物病虫害防治研究。

王洪星（1982-），男，助理工程师，硕士，研究方向：分子植物病理学。E-mail：hxingw@163.com