东北黑斑蛙皮肤抗菌肽的分离及抗菌活性检测

■郝 镯 李 楠 王雅丽 蔡玉峰 李树民 刘 全 王承宇 李吉平

（1.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122；2.吉林农业大学，吉林长春 130118）

饲料添加剂是维持畜禽健康、促进生长、提高家畜肉质品质的重要影响因素，抗生素曾一度作为必需的饲料加剂长期应用于各类饲料中，但是滥用抗生素引起的药物残留及产生的细菌耐药严重危害人类健康[1]。随着人们食品安全意识的加强，迫切要求有一种广谱、安全、高效、无毒的“绿色添加剂”代替抗生素。抗菌肽广泛存在于自然界中，具有广谱的抗菌作用，以及抗病毒、真菌和原虫的作用，且不易产生耐药性[2]，可以代替抗生素添加于饲料中。两栖动物皮肤抗菌肽以其广谱、高效的特性成为研究的热点。本研究以野生东北黑斑蛙为材料，通过对其皮肤分泌物分离、纯化，以期获得抑菌活性较强的抗菌肽，为新型、绿色饲料添加剂的研制与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物与菌种

野生东北黑斑蛙（Rana nigromaculata）100只，其中幼年组50只，体重(5±0.5)g，成年组50只，体重（20.0±0.5）g，采样于吉林省白山市靖宇县。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus,MRSA）、金黄色葡萄球菌（S.aureus ATC29213）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（E.coliATC25922）均购于中国国家菌种冷藏中心。

1.1.2 试剂

三氟乙酸（TFA,Sigma)、乙腈（ACN,Merck)均为色谱纯试剂，α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，ICN），显色剂（TTC，上海威方）。

1.1.3 仪器

高效液相色谱仪（LC-8A，定量环 100 μl，SHIMADZU）、C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，ACE）、高速低温离心机（Eppendorf）、MALDI-TOF/TOF质谱仪（BRUKER）、酶标仪（Thermo）、CO2培养箱（Thermo）、生化培养箱（上海智诚）、96孔细胞培养板（Costar）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽粗品的制备

采用电刺激法[3]，10 V电压间断刺激蛙背部皮肤5～10 min，蛙背部出现无色透明分泌物，用超纯水反复清洗背部皮肤，并收集在一起，低温浓缩，12 000 r/min离心10 min，用10 kD超滤膜超滤，收集滤液，低温保存备用。

1.2.2 抗菌肽活性检测

将大肠杆菌 ATCC25922及金黄色葡萄球菌ATCC25923培养到对数生长期，稀释为0.5个麦氏浓度标准的菌液涂MH培养板，取待检液200 μl制作药敏片，贴附于培养板表面，37℃生化培养箱培养过夜。观察抑菌圈情况。

1.2.3 抗菌肽粗品的初步分离

用高效液相色谱仪对抗菌肽粗品进行初步分离，色谱条件：C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为215 nm；流动相：以超纯水+0.05%TFA为流动相A，以60%ACN+0.05%TFA为流动相B，上样量为75 μl，以1 ml/min流速进行梯度洗脱，洗脱条件为在0-5-25-80-90 min时间段内，流动相B的浓度依次为0%-0%-10%-70%-100%。见峰收集，经浓缩后进行活性检测以确定活性峰。1.2.4 抗菌肽的第二次分离纯化

将上述有较好抑菌作用的洗脱峰进行第二次分离纯化。成年组洗脱梯度如下：0-5-10-50-55 min范围内其流动相B的浓度为0%-0%-10%-70%-100%。幼年组洗脱梯度如下：0-5-10-50-55 min范围内其流动相B的浓度为0%-0%-10%-40%-100%，其余同1.2.3。

1.2.5 抗菌肽的质谱鉴定

取1 μl有活性的抗菌肽组分峰样品，点靶，待样品晾干后，取1 μl HCCA基质点靶。然后将靶放入质谱仪，用FlexControl软件进行数据采集；用FlexAnalysis软件进行数据分析，测出分子量。

1.2.6 最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）的测定

将显色剂TTC用培养基配制成5 g/l，100 μl/孔铺入96孔细胞培养板中。试验采用微量二倍稀释法，用新配制的TSB培养基调整抗菌肽浓度，使其浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/ml，每个浓度设置3个重复。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及MRSA在TSB培养基中培养至适宜浓度，利用麦氏比浊仪调整浓度至0.5个麦氏单位，100 μl/孔铺入培养板中，此时抗菌肽的浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。同时设置阴性对照组（只加培养基）及阳性对照组（只加菌液）。将96孔培养板放入37℃生化培养箱，16 h后观察结果。结果判定：如有细菌生长，TTC会变为红色，将没有细菌生长的最低浓度作为该抗菌肽的MIC值。

2 结果

2.1 抗菌肽粗品的抑菌检测

以大肠杆菌及金黄色葡萄球菌为测试菌，通过药敏片法对抗菌肽粗品的抑菌效果进行检测，成年组与幼年组皮肤抗菌肽粗品均具有抑菌作用，成年组抑菌圈直径分别为22、25 mm，幼年组抑菌圈直径分别为14、18 mm。

2.2 抗菌肽的分离、纯化（见图1、图2）

经HPLC分析，成年组黑斑蛙皮肤抗菌肽粗提物共得到89个洗脱峰，其中62号洗脱峰（AMP1）抑菌效果较好；幼年组共得到34个洗脱峰，23号洗脱峰(AMP2)抑菌效果较好。

2.3 质谱鉴定（见图3、图4）

经质谱鉴定，AMP1及AMP2纯度较高，分子量分别为3 349.205 Da及1 373.820 Da。

2.4 最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration MIC）结果（见表1）

图1 成年组高效液相色谱图

图2 幼年组高效液相色谱图

图3 AMP1质谱鉴定图谱

由表1可知，对AMP1及AMP2最小抑菌浓度的测定结果表明，AMP1及AMP2对G+及G-均有抑菌作用。

3 讨论

目前，将抗菌肽作为饲料添加剂而获得较好饲喂效果的例子很多，如王晓楠等[4]将天蚕素抗菌肽添加入肉鸡的饲料中，提高了肉鸡的生产性能和抗病能力。柴仙琦等[5]通过将不同浓度的抗菌肽添加于凡纳滨对虾饲料中，分别得到了提高对虾成活率、增重率，降低了饲料系数等效果。抗菌肽广泛存在于动物、植物中，从两栖类皮肤分泌物中能够分离出有较强抗菌活性的抗菌肽，所以提取两栖类皮肤抗菌肽是获得天然抗菌肽的一个重要途径。

图4 AMP2质谱鉴定图谱

表1 AMP1、AMP2最小抑菌浓度检测结果(μg/ml)

本试验应用反相高效液相色谱分离东北地区广泛存在的野生黑斑蛙的皮肤抗菌肽，试验发现，在相同的洗脱条件下，幼年组与成年组的分离组分相差较大，即成年组组分较多，而幼年组组分较少，由此可以推断两栖类不同生长阶段分泌抗菌活性成分不同。通过最小抑菌浓度（MIC）试验发现，分离到的两种抗菌肽对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有较强的抑菌效果，尤其是从成年组黑斑蛙皮肤上分离得到的AMP1，对MRSA具有较强的抑制作用。由于生物来源的天然抗菌肽获取数量有限，不能满足现实需要，所以在后续的试验中，我们将对分离得到的AMP1及AMP2进行测序工作，然后进行固相合成，保证动物试验的顺利进行。针对目前细菌抗药性增强的难题，抗菌肽的广谱抗菌作用且不易产生耐药性的特点，使其可以作为传统抗生素的替代品，成为一种新型、绿色饲料添加剂。

4 结论

①野生黑斑蛙皮肤活性成分成年组明显多于幼年组。

②幼年组及成年组野生黑斑蛙皮肤抗菌肽对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均具有抑菌作用，成年组抑菌作用强于幼年组。

③抗菌肽以其抗菌谱广及不易产生耐药性的特点，使其可以代替抗生素，成为新型饲料添加剂。