当归芍药散对蛋鸡O V R基因表达的影响

■ 吴国江 魏 萌 韩愈杰 秦桂芳

(1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071001；2.河北大学中医学院，河北保定071001)

随着养殖业的迅猛发展，蛋鸡产蛋率的高低将直接影响养殖户的经济效益，然而在蛋鸡饲养管理过程中，经常会出现产蛋率下降的情况，虽造成产蛋率下降的原因很多，但多数都是因卵泡发育减少或停滞[1]所致。在正常情况下，卵泡生长、发育过程易受促卵泡素、促黄体素、雌激素、血清卵黄前体物等多种生理因素影响，其中卵黄前体物极低密度脂蛋白(VLDL)和卵黄生成素(VTG)[2]是蛋黄形成的基础，二者在卵细胞卵黄生成受体(OVR，oocyte vitellogenesis receptor)[3]介导下，经内吞方式被转运到卵泡中，并促进卵母细胞成熟[4]，进而提高产蛋率，因此鸡细胞卵黄生成受体（OVR）基因表达量变化是改善蛋鸡产蛋率重要因素[5]。

近年来，国内外学者在当归芍药散的现代药理学研究方面做了大量的工作，阐述当归芍药散在治疗妇科疾病以及对血管神经系统等方面的作用机制[6]，证实了当归芍药散具有调节神经内分泌系统、提高卵巢功能[7]、改善血液流动性和调节血液凝固纤溶系统等作用。本研究以实验室构建的重组质粒为标准品，β-actin为内参基因[8]，通过构建实时荧光定量PCR方法，观察不同浓度当归芍药散添加量对OVR基因mRNA的表达水平的影响，探讨中药对蛋鸡产蛋性能作用机制，为临床研究中药提高产蛋率的分子学机制提供方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

当归芍药散：当归、白芍、茯苓、川芎、泽泻、白术，均购自安国市中药市场，各味药按处方称好，粉碎，按1%、1.5%、2%、2.5%、3%的比例与全价配合料混合均匀，干燥放置备用。

试验动物：39周龄海兰褐商品蛋鸡。

1.2 主要仪器和试剂

TY4133凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；Rotor-GeneTM6000荧光定量PCR仪(Corbett Research公司)；TGradient温度梯度PCR仪（Biometra公司）；超微量分光光度计（thermo scientific公司）。 TransZol Up，TransScript First-Strand cDNA合成试剂盒、Easy-Pure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、Trans-Start DNA Polymerase质粒提取试剂盒、pEASY-T3 Cloning Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、Trans-Start Green qPCR SuperMix（均购于北京全式金生物技术有限公司）。

1.3 试验动物与设计

试验鸡为39周龄海兰褐商品蛋鸡，饲粮预试2周，每天记录产蛋量、蛋重及耗料量，淘汰不产蛋、精神状态差的试验鸡，且体况和产蛋率无显著差异(P＞0.05)后开始正式试验。选取288只鸡，采用单因子试验设计，随机分为6组，每组4个重复，每重复12羽，第2组至第6组分别饲喂添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%中药试验饲粮，第1组为空白对照组，试验期8周。各组饲养管理条件一致，半开放式鸡舍，自由采食与饮水，人工补光，机械通风，定期清粪，消毒。

1.4 样品的采集与制备

试验第8周末，每组随机抽取8只鸡，无菌、无RNAase下，剖开腹腔，取出排卵前卵泡颗粒层、小黄卵泡（SYF）和大白卵泡（LWF）迅速用已经灭菌的铝箔纸包裹，放于标记好的纱布袋中放液氮速冻，然后至-80℃的超低温冰箱保存以备测定OVR基因mRNA相对表达量。

1.5 OVR基因mRNA水平的测定

1.5.1 引物设计与合成

根据GenBank数据库中提供的OVR基因的mRNA序列（登录号GI45382562），运用Oligo 7软件在基因保守区域设计一对引物，上游引物：5′-AGCAAAATGTGAGGAGTCCCAG-3′，下 游 引 物 ：5′-AAGCACTTTCATCACTGCCGTC-3′，目的片段长度为110 bp。内参基因选用β-actin基因，上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAAGGCTA-3′，下 游 引 物：5′-ATTTCTCTCTCGGCT-GTGGTG-3′，序列引物合成由北京全式金生物技术有限公司完成。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.5.2 RNA抽提和反转录

海兰褐种母鸡卵泡总RNA的抽提使用Trizol法提取。cDNA的合成按反转录按试剂盒说明书进行。

1.5.3 引物特异性鉴定标准品的制备

以cDNA为模板，PCR扩增OVR基因，反应体系为25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（10 mmol/l）2 μl，上、下游引物（10 mmol/l）各0.5 μl，Taq酶0.3 μl、cDNA 1 μl，加灭菌双蒸水补齐至 25 μl。循环参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、61℃退火30 s、72℃延伸30 s（35个循环），72℃终末延伸10 min。PCR反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测，用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。胶回收的PCR产物与pEASY-T3载体连接，连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，用Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit提取重组质粒，送北京全式金生物技术有限公司测序。测序正确的阳性质粒作为阳性标准品，参考Giulietti[9]方法计算拷贝数。

1.5.4 标准品的实时荧光定量PCR

以10倍梯度稀释好的标准品为模板，在Rotor-GeneTM6000荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光，获得模板起始拷贝数的对数和临界循环数（Threshold cycle，Ct）的标准曲线和标准方程。

PCR反应为12.5 μl体系：TransStartTMGreen Qp-cr SuperMix(2×)10 μl，上、下游引物各0.25 μl(10 μM),稀释好的标准品模板1 μl，加灭菌双蒸水补齐至12.5 μl。

反应条件：95℃ 5 min；随后进行40个95℃ 5 s，61℃ 15 s，72℃ 10 s的循环，4℃结束反应。

1.6 OVR基因的表达量研究

用以上所建立的实时荧光定量PCR方法检测不同当归芍药散添加量对OVR基因的影响。为了进一步清晰地表示出中药添加组与正常对照组基因表达之间的关系，将对照组的基因表达量调整为1，即用对照组以及中药添加组的基因表达量除以对照组基因表达量的均值，采用唐中林等（2008）[10]的计算方法根据标准曲线和Ct值计算基因的相对表达量。结果采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，方差分析使用One-way anova，多重比较采用LSD法。

2 结果

2.1 引物特异性鉴定

OVR基因的PCR扩增片段在约110 bp处出现1条特异性条带，扩增片段大小与预期结果相符(见图1)，序列经克隆、测序分析表明扩增片段为目的片段。

图1 OVR基因扩增产物

2.2 标准曲线和熔解曲线的分析

PCR产物经回收、克隆、测序后作为标准品，进行10倍系列稀释，选取1.83×102～1.83×107拷贝/μl 6个稀释度进行real-time PCR，扩增曲线（见图2），以Ct值为纵坐标，稀释倍数为横坐标，获得标准曲线(见图3)。结果表明，real-time PCR在1.83×102～1.83×107拷贝/μl反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.999 14，扩增效率为102%。熔解曲线分析表明，无引物二聚体和非特异性扩增，产物呈特异的单个峰，其Tm为(82±0.5)℃(见图4)。

图2 动力学曲线

图3 标准曲线

图4 熔解曲线

2.3 OVR基因的表达研究

表1结果表明，饲料中添加2%的当归芍药散对鸡OVR基因的表达量有极显著影响。

表1 当归芍药散对鸡OVR基因的表达量的影响

3 讨论

在蛋鸡繁殖活动中，卵母胞膜表面蛋白OVR数量是影响卵细胞发育成熟的重要因素之一[11]，且在鸡体内，OVR只在卵巢中表达，其他组织几乎无任何表达[12-13]。OVR是由位于Z染色体上的基因编码，激素、食物等因素可调控OVR mRNA的表达量[14-15]，若编码OVR基因位点发生突变，即使循环血量极低密度脂蛋白(VLDL)卵黄生成素(VTG)含量正常，卵母胞因缺乏具有介导细胞内吞功能的OVR而不能发育成熟，导致产蛋能力下降[16]，因此研究卵细胞卵黄生成受体(OVR)调控基因的表达量，对提高产蛋鸡的生产性能尤为重要[17]，本研究采用通过PCR扩增考察调控OVR基因表达量，分析当归芍药散对鸡卵泡发育过程中OVR基因表达量变化。

实时荧光定量PCR按着PCR动力学变化规律，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，并以荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所需要的最少循环数(称为循环阀值,Ct)建立标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，反映荧光信号与模板浓度对数间的线性关系[18]，现已成为定量分析mRNA表达水平最广泛使用的技术之一[19]，并在分子诊断、基因表达研究、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用[20]。

试验采集饲喂不同浓度当归芍药散的蛋鸡卵泡，建立了OVR基因的实时荧光定量PCR方法，结果显示，扩增效率为102%，检测范围Ct值为10～27，熔解曲线为特异的单峰，检测范围间有良好的线性关系（R2=0.999 14），通过荧光定量PCR检测添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%5个浓度当归芍药散的鸡卵泡，发现饲料中当归芍药散添加量为2%时，对OVR基因有极显著影响（P＜0.01）。由此可以看出当归芍药散对鸡产蛋率有很好调控作用。

4 结论

①本研究所建立的SYBR Green I荧光定量PCR特异、快速、准确。可用于测定鸡OVR基因的表达量。

②当归芍药散可调控蛋鸡的OVR基因表达，影响蛋鸡产蛋率。