金属蛋白酶分子系统与肝纤维化研究△

王 梅 董珉翔 常 亮

(1.内蒙古自治区妇幼保健院，内蒙古 呼和浩特 010020;2.内蒙古自治区医科大学2011级研究生;内蒙古 呼和浩特 010000;3.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010069)

肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理特征。是肝损伤修复过程中细胞外基质(ECM)激活-合成-分泌-降解失控导致ECM在细胞间过渡沉积，改变肝组织结构。许多因素参与了这一过程，MMPs与 TIMPs是其中因素之一。MMPs可以降解所有ECM成分，TIMPs可与MMPs结合形成复合物抑制降解活性，二者调节失衡不能有效降解ECM是肝纤维化的病理基础之一。调节MMPs与TIMPs基因表达是防治肝纤维化与其他纤维化疾病的有效途径。MMPs是一组基质金属蛋白酶，在肝内主要有肝星状细胞(HSC)和枯否氏细胞表达，是一类Ca-Zn离子依赖型的内源性蛋白水解酶，因需要Ca+2-Zn+2等金属离子作为辅助因子参与而得名。迄今发现的唯一能降解纤维类胶原酶系统。几乎可降解所有的ECM成分，在生理病理过程中发挥重要作用。MMPs家族由24种成员组成，共有23中存在于人体中。

1 MMPs分类

(1)胶原酶类:主要包括 MMP-1、-8、13、18。他们能够降解间质胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，可消化多种ECM及可溶性蛋白。MMP-1又称纤维细胞型，是人类主要的间质胶原酶，结缔组织、肝内HSC、肝细胞、枯否氏细胞均有分泌，分解底物为胶原蛋白。-13是鼠类的间质胶原酶。-8是中性粒细胞胶原酶，主要降解Ⅰ型胶原。(2)明胶酶类:包括MMP-2与-9，可降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ胶原，层粘连蛋白、蛋白聚糖。MMP-2也可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原，其活性较MMP-1弱。(3)基质分解素:主要有MMP-3、-10、-11，仅有MMP-3在肝脏中存在，底物有蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白Ⅳ胶原、明胶等。MMP-3与-10有相似的结构及底物，但MMP-3水解效率较-10高，除降解ECM成分外，还可以降解激活的多种MMPs酶原。-11对ECM降解作用较弱。(4)基质溶解因子:有MMP-26、-7，在正常组织中MMP-26在内皮细胞里有少量表达，MMP-26可以降解许多ECM成分，大多储存在细胞内。(5)膜金属蛋白酶(MMPs):这一类蛋白酶主要储存在细胞膜上，有广泛的底物特异性，其中有4个是1型跨膜蛋白(-14、-15、-16、-24)，两个GPI锚链蛋白(-17、-25)，这些酶可以降解许多ECM分子。主要在肝的HSC细胞表达，与TIMP-2MMP-2共同调解胶原代谢。其他种类的MMP-s，有-12、-19、-20、-21、-23、-27、-28。 -12主要在巨噬细胞中表达，对巨噬细胞的迁移有作用;-28在角质细胞可见，参与机体止血与组织修复。-12、-19、-20主要的底物为胶原、层连蛋白、和IV型胶原。

2 MMPs的调控、激活、表达与底物分解

主要有3个方面，酶基因表达-酶原激活-酶活性抑制。(1)表达水平的调控:正常人体大多数MMPs表达较低水平，但在各类炎症因子、激素、生长因子、CD40的作用下，不仅能促进或者抑制MMPs mRNA转录，且能影响半衰期。对表达有上调作用的有TNF-α、IL-1、血小板生长因子与成纤细胞生长因子(FGF)，起下调作用的有转化生长因子-β(TGF-β)、视黄酸、血管紧张素2和糖皮质激素。增强与抑制因子多作用于MMPs基因的前肽区。(2)活性水平的调控:MMPs都以酶原的形式分泌，活化后才有作用。活化方式有3种，逐级活化，可由血清蛋白溶解酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽酶介导。体内最主要的是MMPs激活系统是血清蛋白溶解酶系统。MMPs的前肽结构被血清蛋白溶解酶水解，酶活性中心暴露，被其他水解蛋白酶激活。膜型MMPs激活为细胞内激活，细胞内激活的精确机制和细胞外的MMPs活性作用机理不清。(3)MMPs的活性抑制物。激活的MMPs可被蛋白酶水解或抑制，但主要被特异的TIMPs酶抑制。

3 TIMPs酶分类、功能、活性调节

MMPs的表达及活化并不能代表最后的降解能力，因为体内还存MMPs抑制剂TIMPs系统，可抑制MMPs表达，在ECM代谢中起调节作用。目前发现4种TIMPs，根据发现的顺序命名为TIMP-1、-2、-3、-4，是广泛存在在组织体液中的活性多肽，可由成纤细、上皮细胞、内皮细胞产生。TIMP-1、-2、-4，为可溶性蛋白分子，TIMP-3仅存在于ECM中并于其紧密结合。TIMPs有各自的独立表达基因，但4种的氨基酸顺序有同源性，都可与特定的MMPs结合，通过共价键1:1结合成复合物。抑制对ECM的降解，这种共价键在生理情况下是可逆的，在肝脏的HSC中表达TIMP-1、-2、-3较多。TIMP-1对肝纤维化的诊断明显高于TIMP-2。TIMP-1还在肝枯否氏、肌纤母细胞产生，是体内作用与存在最广泛的TIMPs。他可以结合除-14、-19以外的所有MMP-s，使其作用减弱，可有效抑制除MMP-2和膜型MMPs外的大多数MMPs，是MMP-9的特异性抑制剂。TGF-β、IFN、TPA、IL-1、IL-10、NO 能够诱导TIMP-1的基因表达。TIMP-2是IV胶原酶MMP-2特异型抑制因子，TIMP-2/MMP-2系统是IV胶原增生、沉积、降解有重要调节作用。

4 TIMPs与MMPs抗肝纤维化的策略

肝硬化是肝实质性病变，不可逆转，而肝纤维化是可逆性病变。因而研究肝纤维化机理，寻求阻断肝纤维化的有效方法，对控制肝病进展又十分重要意义。鉴于TIMPs与MMPs在肝纤维化过程中作用不同，增加MMPs的合成，减少TIMPs的合成，是防止肝纤维化的新途径。目前国内治疗肝纤维化手段大多数是MMP-1、2表达来实现肝纤维化的逆转。运用DNA重组技术构建可以表达大鼠MMP-1基因和反义TIMP-1序列的真核表达质粒，将其导入免疫损伤性肝纤维化大鼠体内，观察MMP-1和TIMP-1重组表达质粒对肝纤维化的影响;结果显示，MMP-1和反义TIMP-1重组表达质粒可促进肝脏中I、II、III胶原的降解，病理形态学显示MMP-1和反义TIMP-1重组表达质粒对肝纤维化有一定的逆转作用。CCl4损伤下，用人抗鼠TIMP-1抗体后胶原沉积减少，有效组织肝纤维化发展。选用TIMP-1为靶基因，将表达反义TIMP-1重组质粒导入人体外培养的HSC内，TIMP-1基因与蛋白表达明显下降。用腺病毒和MMPs基因重组导入肝纤维化鼠体内，可明显降低肝纤维化作用。TGF-β1为最有力的促肝纤维化因子，在肝纤维化启动、进展及硬化起到核心作用，是激活HSC促使分泌表达ECM的关键因素，除抑制间质胶原酶和基质溶解素表达外，同时还具有促进TIMP-1和TIMP-2作用。尤其在肝损伤之后，肝HSC对TGF-β1的自分泌与旁分泌作用。阻断TGF-β1信号通路是阻断肝纤维化的理想选择。肝纤维化过程中TIMPs-MMPs的调控机制、细胞来源、EMC各种成分之间与细胞之间相互关系等大量的问题仍有待研究。但是，人们逐步认识到MMPs/TIMPs肝纤维化的作用，研制出可抑制增强MMPs活性，抑制TIMPs活性的药物，或者阻断上游信号通路间接抑制TIMPs活性，增加MMPs活性从而抑制或逆转肝纤化。