猪早期胚胎发育调控相关的因子

陈预明 陈志林 卫恒习 李 莉 张守全

（1华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；2广东广三保养猪有限公司，广东广州 510630）

猪早期胚胎发育调控相关的因子

陈预明1,2陈志林1卫恒习1李 莉1张守全1

（1华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；2广东广三保养猪有限公司，广东广州 510630）

早期胚胎发育指的是着床前阶段胚胎所经历的生长和分化过程。猪早期胚胎发育过程是由多种作用因子共同调节着床前胚胎的生长和分化，从而保证胚胎的正常发育。在此过程中，相关因子的调控起着关键性的作用，不仅可以促进胚胎正常的着床，也能够诱导功能异常的胚胎凋亡，降低子代的畸形率。本文主要对几类与调控相关的因子作简要概述，以说明其在猪早期胚胎发育过程中所发挥的功能性作用，同时也为相关学者提供简单的参考。

猪；早期胚胎；发育；调控因子

猪早期胚胎的发育是指着床前阶段胚胎所经历的生长和分化过程，时间约为12天。研究表明在早期胚胎发育过程中可以检测到许多与胚胎生长发育相关的基因或蛋白调控因子。这些因子不仅可以促进胚胎正常的着床和发育，也能够诱导异常胚胎的凋亡[1]。此外，弄清其基因的表达调控，对于研发适合猪胚胎干细胞维持其多能性的培养基显得犹为重要。近年来，随着早期胚胎作为细胞形态发生和分化模型的重要性日益增加，越来越多的作用因子被发现与早期胚胎发育相关。因此，本文对猪早期胚胎发育过程中主要的几类因子表达简要概述，以说明这些因子所发挥的重要作用。

1 原癌基因

猪原癌基因是一种酪氨酸激酶受体，为单拷贝基因，全长大约200 kb，由21个外显子组成，整个编码序列长2 919 bp[2]。SakuraiMt等采用荧光原位杂交技术证实了原癌基因位于8号染色体短臂1.2区（8p l2），同时也发现原癌基因是一个可以控制毛色的基因[3]。此外，其对猪的造血和繁殖效应也有一定影响。

1.1原癌基因对猪毛色的影响

猪毛色的显性白表型往往是原癌基因的基因突变造成的[2]。原癌基因基因内含子17的第1个核苷酸处发生G→A剪接突变，导致皮肤和毛囊不能生成黑色素细胞而产生白色[4]。SakuraiMt等研究指出猪的显性白毛色主要由原癌基因基因（I位点）调控[3]，但师科荣等的研究发现白毛产生的现象并不是全部由原癌基因基因内含子17中G→A的突变和内含子18中的AGTT缺失所导致，同时也存在其他区域且未被发现的决定性SNP（Sing le Nuc leotide Polymorphisms，即在基因组上单个核苷酸的变异）[2]。然而这种SNP很可能是导致荣昌猪白毛色形成的主要原因。随后白小青和Lai等的研究结果也分别证实了荣昌猪白毛色并不是由于原癌基因基因内含子17和18这两个位点突变引起[5-6]。

1.2原癌基因对猪造血效应的影响

原癌基因造血干细胞因子受体为酪氨酸蛋白激酶受体，其产物广泛存在于造血干细胞表面，特别是早期胚胎的造血干细胞表面，扮演着传递生物信号的重要角色。一旦与配体SCF（stem cell fac tor）结合后，可激活多种信号转导通路，使其他造血生长因子对造血细胞的作用得以增加，并对造血细胞的凋亡、增生、分化和转移进行调控[7]，但潜在机制仍不清楚。原癌基因的突变将会导致贫血病，外周血液中的红细胞、白细胞、血红蛋白和血小板等生化指标均比正常值低。如果SCF/原癌基因异常则会引起造血微环境紊乱，原癌基因的无义突变可导致其功能完全丧失，大大减少红细胞的生成量。畜牧业生产中白毛猪新生仔猪患贫血的比例要比有色猪高，继而引起以下一系列问题：母猪贫血则易不孕、产仔数减少和仔猪发育迟缓；初生仔猪贫血则精神不振、活力减弱甚至吮乳力不足，消瘦、皮肤和黏膜苍白、下痢；生长肥育猪贫血可致其生长发育滞后，生产性能降低。仔猪贫血发病率超过30%，由此导致的死亡率超过15%，导致生猪生产遭受巨大的经济损失[8]。

1.3原癌基因对猪繁殖效应的影响

原癌基因参与动物生殖细胞的形成、发育和存活过程的调控，对繁殖起着必不可少的作用。原癌基因突变的猪在纯合状态下是完成可育的、不致死的[4]，这对养殖生产的影响极大。原癌基因在原始生殖细胞、A型精原细胞、精子细胞的顶体及其颗粒均有表达，有利于减数分裂的完成[9]。研究表明原癌基因突变后睾丸中分化的精原细胞明显减少，并在精子发生过程中发挥决定作用[10]。由于编码SCF/原癌基因位点的突变，因此将直接影响生精细胞的发育。此外原癌基因在卵母细胞和内膜细胞内也有表达，其受体在卵泡发育过程中的原始卵母细胞和生长卵母细胞及卵泡膜间质细胞中表达。携带原癌基因突变基因纯合子的雌性动物大多数表现为不育。Fesus等发现I/I型的公猪睾丸比其他型的公猪睾丸要大，I/I型母猪卵巢的各项参数值均是所有原癌基因型猪中最小的，但其退化和萎缩的卵泡数量是最多的[4]。

2 白血病抑制因子

白血病抑制因子（Leukaem ia Inhibitor Fac tor,LIF）为白介素6（IL-6）家族中的一员，是典型的多功能生长因子，对于细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，同时与胚胎发育、神经发育和造血系统的发育有密切联系[11]。LIF是目前研究最多、应用最广的一种胚胎干细胞（ES）分化抑制因子，主要应用于胚胎干细胞的体外培养和研究。猪的LIF基因长约6.3 kb，有5个外显子，其染色体位置为14q2.1-q2.2。目前已发现两个单核苷酸多态点（SNP），其中一个位于外显子1，另一个位于外显子3的UTR区[12]。猪LIF基因在胚胎附植前的子宫内膜表达，而胚胎表达LIF的受体[13]。Hall等研究表明猪LIF因子可与ES细胞表面的LIFR/gp130受体结合[14]。随后Wianny等则证实了LIF因子与LIFR/gp130结合后可以激活JAK-STAT3通路[15]。

一般而言，母猪的胚胎损失率约为40%，而附植前胚胎死亡率约为20%[16]，是产前损失最严重的阶段[17]。Spotter等利用德国大白和杜洛克合成系母猪进行研究发现在第一胎母猪中LIF基因AB型母猪（外显子3 SNP，下同）的产仔数显著低于AA或BB型母猪[18]，呈负显性效应（P＜0.05）；同时也发现在德国长白第一胎母猪中AB型母猪产活仔数显著高于其他基因型的母猪，突变纯合子产活仔数最低[19]，然而在大白母猪的差异不显著。但Lin等发现在我国广东某猪场中大白母猪的BB型产活仔数显著高于AB型[20]。另外张豪等在2011年也发现我国温氏猪场长白母猪AA和AB基因型母猪产仔数接近，均显著或极显著高于BB基因型，且第一胎A等位基因的效应高于其他胎次[21]。虽然目前研究的结果不尽相同，但主要原因很可能是由于所研究的SNP与性状处于不同的连锁相，而我们可以肯定的是LIF基因可作为影响猪产仔数的候选基因。

3 胰岛素生长因子

胰岛素生长因子（insulin-like g row th factor,IGF）是多肽生长因子，IGF-I、IGF-II及各自受体和结合蛋白（IGFBP1-7）构成IGF系统。IGF-I和IGF-II分别由70和67个氨基酸组成，在猪的卵巢、子宫、输卵管和早期胚胎中均有表达。通过内分泌、旁分泌或自分泌，IGF与靶细胞表面的特异受体结合起到调节相应组织生长发育的作用。与此同时也可以影响母猪的卵巢功能、子宫发育、促进卵母细胞和囊胚发育、参与胚胎雌激素的生成、调节子宫中的基因表达和影响胚胎的着床[22]。

猪妊娠前期即胚胎早期，IGF-I能够刺激卵巢细胞产生孕烯醇酮和孕酮，能与FSH协同作用，促进孕酮生成。猪胚胎快速延长期的子宫腔液中存在IGF-I、IGF-II，能够控制子宫细胞的增殖和分化，重塑子宫内环境，做好囊胚附植的准备。Geisert等研究表明，母猪妊娠10天左右子宫液中主要的结合蛋白是IGFBP-2和IGFBP-3，随着组织激肽释放酶活性的增加，在激活细胞间质中金属蛋白酶作用下分解IGFBP-2和IGFBP-3，使子宫释放IGF-I和IGF-II到子宫腔中促进胚胎发育[23]。同时Green等也发现子宫内膜IGF-I通过参与调节胚胎细胞色素P450芳香酶mRNA的表达量来调节雌激素的生成，从而维持胚胎的生长发育[24]。另外Sallaberry等研究结果显示IGF-I对SSAT的短期调节可使IGF-I与胚胎细胞因子参与妊娠早期母猪子宫内膜与孕体发育的调节，从而影响附植胚胎的发育[25]。

4 转录因子

猪早期胚胎中，有三种转录因子表达，分别是Oct4、Sox2和Nanog。这三种因子共同作用于早期胚胎，但时间上和组织上的表达与人和小鼠有明显差异[26]。其中Oct4是由POU5F1基因编码产生，是含POU结构域的转录因子家族中的一员，是最早发现的多能性基因。Sox2基因是继Oc t4之后发现的重要多能性基因，其通过结合DNA上保守序列来调控基因表达，表达于内细胞团、上胚层、生殖细胞和胚外外胚层中。随着组织分化的进行，Sox2表达逐渐减弱。另外Nanog是维持表皮干细胞（ep idermalstem cells,ESCs）全能性的又一重要转录因子，表达于小鼠胚胎发育早期致密型桑椹胚的内部以及囊胚中的内细胞团，Nanog在分化细胞中呈现低表达或不表达状态。研究表明敲除Oct4的小鼠胚胎在着床前期出现异常[27]；敲除Sox2基因的小鼠胚胎能着床，但随后会发生死亡。Sox2因子缺失的胚胎，上胚层严重丢失，且胚外的组织结构紊乱[28]；敲除Nanog基因的小鼠胚胎在着床后很快死亡。

2009年，Hall等[14]研究发现猪胚胎形成5～6天后，无论囊胚还是内细胞团均缺少Nanog和Sox2的表达，然而Puy等[29]研究表明在8.5天内细胞团时期和10.5天外胚层时期，Oc t4在滋养层核心细胞内均有表达，但在内细胞团和外胚层无表达；而Nanog则在这两个胚龄的内细胞团和外胚层表达，相反地在滋养层和内胚层内无表达；Sox2的表达模式更是严格地受内细胞团和外胚层控制。可见Oc t4、Sox2和Nanog随着胚龄的差异表达的量和组织均有所不同。多个研究发现仅在猪外胚层10天时，Oc t4、Nanog和Sox2才共同表达[29]。猪早期胚胎囊胚和内细胞团中有着与灵长类和小鼠不同的独一无二的表达图谱，但是这些转录因子在不同物种间外胚层中的表达则趋于相同[29]。但无论如何，这三种因子对培养胚胎干细胞（emb ryonic stem cell,ES）的作用是毫无疑问的，添加与否直接影响ES细胞是否能够维持多能性[30]。

Oct4、Sox2和Nanog是研究最详细的多能性基因之一，三者均通过正反馈调控了自身的表达，而自身的表达还受到其他两者的正调控，三者或许通过这种正反馈调控机制以及对相同靶基因的调控，建立了表达和功能上的彼此联系。2009年，张鑫淼实验结果证明猪Oct4基因过表达能够在成纤维细胞中上调多个多能因子，其中Sox2表达量提高了3倍，Nanog基因的表达量上调4倍左右[28]。这也证明了在诱导重编程中Oc t4基因同样具有激活多种因子的表达作用，同时Oct4的单独作用也可实现促进相关基因的高度表达。

5总结

本文主要对与猪早期胚胎发育相关的原癌基因、白血病抑制因子、胰岛素生长因子和若干转录因子进行综述，以说明其在猪早期胚胎正常发育过程中发挥重要的功能性作用。这些因子在猪胚胎着床前对胚胎的生理功能进行严密调控，同时也参与早期胚胎的生长发育和凋亡等。胚胎着床前相关因子的调控关系到猪胚胎损失率的高低，同时也影响子代的生理功能。弄清这类因子的调控模式，不但可以有助于猪ES细胞的体外培养，也有助于生产上减少胚胎凋亡，从而提高子代的存活率，提高养殖业的生产效率。

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