骨髓间充质干细胞和抗生素对乳腺炎模型大鼠血清中急性期蛋白水平的影响

王 波 张 彤

(东风公司总医院外科，湖北 十堰 442008)

乳腺炎是女性哺乳期常发的一种疾病，主要是由于乳腺排乳不畅导致乳汁淤积加上细菌感染所致〔1〕。其是一种典型的炎性变化〔2〕，表现为红、肿、热、痛。大肠杆菌是临床最常见的乳腺炎菌株，发生乳腺炎时病原体与其产生的内毒素(LPS)等能诱导乳腺局部炎症细胞的浸润，从而导致体内的肿瘤坏死因子(TNF-α)白细胞介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)等炎性细胞因子增加。一方面这些细胞因子能够趋化免疫细胞从而清除病原体；另一方面炎症发展也会引起乳腺的微循环障碍，导致乳腺组织坏死、无乳、化脓，长期还会导致纤维化进而永久丧失泌乳功能〔3〕，因此采用适宜的方法控制乳腺炎患者体内炎症的发展对乳腺炎的治疗作用重大。大量研究表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)除了保留一部分的多向分化能力以外，其还具有明显的免疫调节功能〔4〕，能降低受损部位的炎症反应，对受损组织起到保护作用。本研究向乳腺炎模型的SD大鼠乳房基部注射一定量的BMSCs或抗生素，旨在研究其对乳腺炎大鼠血清中的炎性细胞因子水平，以期为乳腺炎的治疗提供新的思路与依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 大肠杆菌内毒素(LPS)购自SIGMA公司；L-DMEM、胎牛血清购自Gibco公司；大鼠TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP ELISA试剂盒购自Bender公司。注射用氨苄西林钠0.5 g购自张家界市长康制药有限责任公司。

1.2分组及设计 体重约350 g SPF级待产大鼠80只购自武汉大学实验动物中心。采用乳头管灌注内毒素的方法建立乳腺炎模型。灌注内毒素后24 h定义为d0，分为正常对照组、对照组、抗生素组、BMSCs组。正常对照组5只，其余每组25只，分别于d1、d3、d5、d7各组分别采取断尾法获取血液，制备血清，置于-80℃冰箱保存待测。正常对照组不注射LPS于-d1直接取血清检测，对照组、抗生素组、BMSCs组于产后72 h经乳头管注入50 μl，1 μg/μl LPS，24 h观察乳腺感染情况，有明显乳腺发红、肿胀、局部温度升高的纳入实验〔5〕。治疗方案均为往乳房基部注射，对照组注射生理盐水，抗生素组注射抗生素50 μl(5 000 U/侧，注射LPS后24 h与48 h注射2次)，BMSCs组注射BMSCs 50 μl(106个，注射内毒素后24 h注射1次)

1.3BMSCs的制备与培养 颈椎脱臼处死大鼠，75%酒精浸泡消毒，无菌取双侧股骨和胫骨，于磷酸盐缓冲液(PBS)中剪断两端骨骺，PBS反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔清亮，用NH4Cl红细胞裂解液去除红细胞，收集骨髓细胞，移至培养瓶(含10%FBS的L-DMEM)中，轻轻摇匀，置于CO2细胞培养箱中培养。48 h后换新鲜培养基除去未贴壁的细胞，以后每隔3天换一次液，当贴壁细胞达到80%融合后，0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶3的比例传代培养。取第3代细胞留用。

1.4ELISA检测 根据试剂盒说明书绘制标准曲线，采纳相关系数>0.99的标准曲线。每组先等量混合5只小鼠血清后成为一个样品，每个样品做3个复孔，取各孔平均值，检测过程无异常。

2 结 果

用ELISA方法检查不同组在不同时间点的血清中急性时相反应蛋白的浓度，发现注射内毒素24 h后所有乳房肿胀、局部温度升高的小鼠的TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP均明显上升(均P<0.05)，对照组各炎性细胞因子在观察期间均逐渐下降。使用抗生素与BMSCs后d1～d7 TNF-α、IL-8均比d0低且TNF-α还比同日对照组要低(均P<0.05)，使用BMSCs则使CRP持续低于对照组(P<0.05)，BMSCs组d5、d7的IL-6明显高于同日对照组(P<0.05)。BMSCs组的IL-1β只有d7与同日对照组无统计学意义(P>0.05)，d1、d3、d5均低于对照组(均P<0.05)，与同日抗生素组对比，IL-8与CRP在d5、d7均比抗生素组要低(P<0.05)。见表1。

表1 处理后各组血清炎性细胞因子浓度

3 讨 论

乳腺炎的致病菌以大肠杆菌最为常见，而LPS是其致病的主要物质之一，其感染乳房后能引起乳房红、肿、热、痛。当前实验用乳腺炎动物模型的主要方法是采用乳房内注射LPS〔5〕。乳腺炎的预后与转归与其炎症发展进程紧密相关，及早地清除病原体并去除局部炎症环境是其治疗的主要目的。为了研究乳腺炎发展过程中体内炎症反应的发展状况，本研究采用乳头管灌注LPS的方法建立乳腺炎模型，模型小鼠均表现为乳房肿胀与局部发热，且其血清中的炎性细胞因子浓度均上升，说明本实验成功建立了乳腺炎模型。

LPS诱导的急性炎症反应与细胞因子的含量升高关系密切，且炎性细胞因子还能继发性的导致浸润到局部的炎症细胞增多〔6〕，中性粒细胞和巨噬细胞就是早期浸润的细胞，巨噬细胞能产生TNF-α、IL-6、IL-8，又能使中性粒细胞产生更多的炎症因子及增强其脱颗粒能力，增加组织中的髓过氧化物酶(MPO)量，MPO使血管内皮肿胀、血小板淤积导致乳腺内微循环障碍，乳房肿胀疼痛〔7〕。BMSCs能表达Toll样受体(TLR4)，能与LPS结合表现出与巨噬细胞、LPS结合不一样的效应，前者能促进自身分化并阻止其余巨噬细胞的结合，或诱导巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子，二者结合后主要起到识别病原体、激活自身已达到清除病原体的作用。这可能是BMSCs能降低乳腺炎炎症反应程度的机制之一。

本研究发现，在小鼠不采取治疗方案的对照组各炎性细胞因子在观察期间均表现为逐渐下降，这可能和其炎症在逐渐自身消退有关，使用抗生素与BMSCs后TNF-α、IL-8明显低于对照组。BMSCs还能使CRP持续低于对照组，这与BMSCs能保护受损组织，降低其局部炎症反应有关〔7～9〕。采取注射LPS方式模拟的乳腺炎组织中病原菌数量较少，而抗生素也能起到类似BMSCs降低炎症反应的作用，可能和抗生素其自身也能进入炎症细胞里且还能破坏炎症细胞的吞噬功能相关〔10〕。IL-2的水平在各组区别无统计学差异，其可能是注射BMSCs的次数与数量较少所致，也可能是由于IL-2主要由激活的辅助T细胞产生，在观察期内，还没有完全发挥作用。

乳腺是一个功能调控比较复杂的组织，受到众多因子的影响，包括神经递质、抗体、酶、细胞因子等。乳腺炎发生后，局部及全身过度表达的炎症细胞因子会影响乳腺炎的预后，导致其功能发生紊乱。本研究为进一步采取降低炎性反应的方法治疗乳腺炎提供了一些依据。

4 参考文献

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4Ming LG,Chen KM,Xian CJ.Functions and action mechanisms of flavonoids genistein and icariin in regulating bone remodeling〔J〕.J Cell Physiol,2013；228(3):513-21.

5钟 凯,王艳玲,邹思湘,等.乳头管灌注内毒素诱发大鼠实验性乳腺炎模型的建立〔J〕.农业生物技术学报,2005；13(5):654-8.

6苗晋锋,马海田,邹思湘,等.内毒素对山羊乳腺组织中与乳腺炎相关的酶和细胞因子的影响〔J〕.福建农林大学学报(自然科学版),2007；36(6):608-13.

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8Tögel F,Hu Z,Weiss K,etal.Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2005；289(1):31-42.

9李文媛,王 莹,管业秋,等.骨髓间充质干细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤炎性细胞因子的影响〔J〕.牡丹江医学院学报,2011；32(2):1-4.

10Boulanger D,Bureau F,Mélotte D,etal.Increased nuclear factor kappaB activity in milk cells of mastitis-affected cows〔J〕.J Dairy Sci,2003；86(4):1259-67.