糖尿病合并肺结核患者肺部病灶组织中细胞因子的表达及意义

张放，杨飞

（1.中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所，沈阳 110001；2.沈阳市胸科医院老年病科，沈阳 110044）

糖尿病合并肺结核患者肺部病灶组织中细胞因子的表达及意义

张放1，杨飞2

（1.中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所，沈阳 110001；2.沈阳市胸科医院老年病科，沈阳 110044）

目的比较单一肺结核与糖尿病合并肺结核患者的肺部病灶组织中TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10的表达，探讨肺结核、糖尿病合并肺结核患者的细胞免疫功能变化及其意义。方法 应用免疫组化SABC法检测13例肺部良性病变患者、45例单一肺结核患者、15例糖尿病合并肺结核患者的肺部病灶组织中TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10的表达，并对阳性细胞的平均光密度（AOD）进行定量比较，AOD值采用秩变换后，进行方差分析，采用LSD检验方法进行两两比较。结果 TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10在坏死区周围炎性反应带表达明显，糖尿病合并肺结核组中TNF⁃α、IFN⁃γ的AOD值低于肺结核组（P<0.05），而IL⁃10的AOD值高于肺结核组（P<0.05）；肺结核组TNFα、IFN⁃γ的AOD值高于对照组（P>0.05），而IL⁃10的AOD值低于对照组（P<0.05）。结论 TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃10这些细胞因子参与了肺结核的局部免疫反应；糖尿病患者存在局部细胞免疫反应降低。调节糖尿病患者局部组织中的细胞因子，将可能成为糖尿病合并肺结核患者免疫治疗的一种新的途径。

TNF⁃α；IFN⁃γ；IL⁃10；糖尿病；肺结核

糖尿病患者易并发肺结核，其发病率大约为10%～15%，与非糖尿病患者比较，糖尿病患者感染肺结核的发病率是其2～5倍［1］。这可能与糖尿病患者的Th1型相关细胞因子及一氧化氮酶低表达，限制了宿主对结核分枝杆菌的免疫反应相关［2］。而在肺结核患者中，主要以Th1型细胞因子介导的细胞免疫为主，糖尿病患者的细胞免疫功能下降，使机体不易清除结核分枝杆菌。天然免疫细胞因子TNF⁃α、Th1型相关细胞因子IFN⁃γ，它们抗结核分枝杆菌的作用已得到认可［3，4］。而Th2型相关细胞因子IL⁃10，在结核分枝杆菌感染的过程中作用尚不完全确定。目前对糖尿病合并肺结核的研究多是关于血浆中各细胞因子的表达水平［5］，不能准确反应病灶的局部细胞免疫水平。本研究应用免疫组织化学方法对糖尿病合并肺结核患者肺部病灶组织中的TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃10进行检测，使人们进一步了解肺结核及糖尿病合并肺结核的局部免疫，探讨糖尿病在肺结核患者中对细胞免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象：选择2009年4月至2010年9月在沈阳市胸科医院住院并行肺叶切除术患者，男50例，女患23例，年龄25～66岁。

1.1.2 分组：（1）对照组：选取同期住院的其他肺部良性病变患者13例，男9例，女4例，年龄（50±6）岁，其中炎性假瘤3例、错构瘤1例、曲菌球1例、支气管扩张7例及肺炎1例。取手术切除的肺组织病变周围的正常肺组织。（2）肺结核组：选取住院的单一肺结核患者45例，男29例，女16例，年龄（44±8）岁。（3）糖尿病合并肺结核组：选取同期住院的糖尿病合并肺结核患者15例，男12例，女3例，年龄（48±7）岁；均为2型糖尿病，病史1～10年。术前平均血糖（9.7±3.2）mmol/L，术后平均血糖（8.2±2.3）mmol/L，手术前后血糖无统计学差异（P>0.05）。3组年龄比较无统计学差异（P>0.05）。

1.1.3 诊断标准：肺结核诊断均由病理证实。2型糖尿病诊断标准按2010年ADA糖尿病诊断标准：（1）糖化血红蛋白A1c≥6.5%或（2）血糖FPG≥7.0mmol/L。空腹定义为至少8h内无热量摄入或（3）口服糖耐量试验时2h血糖≥11.1mmol/L或（4）在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖≥11.1mmol/L。而在无明确高血糖时，应通过重复检测来证实标准（1）～（3）。

1.1.4 排除标准：合并免疫系统相关疾病，心、肾功能衰竭，支气管结核，肿瘤；人免疫缺陷病毒阳性；近期应用免疫调节剂。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：分别收集3组肺组织（1cm×1cm×1cm），用生理盐水冲洗干净，置10%甲醛液固定24h后，低温石蜡包埋，制成石蜡切片。

1.2.2 测定方法：（1）标本处理：常规切片行HE染色复查诊断；（2）免疫组化方法：采用免疫组织化学染色SABC法，所有试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，染色时一抗均为兔抗人的多克隆抗体，工作浓度均为1∶150，二抗为山羊抗兔IgG。按试剂盒提示进行操作。（3）结果判断：显微镜下观察各组中HE染色后的组织结构，观察免疫组化反应的定位、分布及染色强度，每张切片阳性细胞的着色为棕黄色和棕褐色，并且阳性细胞数>5%认为阳性表达。每例均设有HE切片作对照观察，并设阳性和阴性对照，用IPP6.0（image pro plus6.0）分析图片，计算平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.3 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，所有定量资料的描述，若正态分布，以±s表示。多组间均数比较采用方差分析或采用LSD检验方法进行两两比较。P<0.05判定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10在各组的免疫组化染色结果

TNF⁃α、IFN⁃γ在对照组中以胞质及胞膜为主的较淡少量的棕黄色改变；肺结核组在上述部位的表达增多，在胞质及胞膜呈棕黄、褐黄色改变，明显高于背景颜色，且分布不均匀、呈散在分布、局灶性表达；而在糖尿病合并肺结核组表达最弱。IL⁃10的表达以胞质及胞膜为主，在肺结核组表达最弱，糖尿病合并肺结核组较结核组增强。见图1。

2.2 TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10的AOD计数结果

与对照组比较，，糖尿病合并肺结核组TNF⁃α AOD值明显降低（P<0.01）；与肺结核组比较，TNF⁃α在糖尿病合并肺结核组也明显降低（P<0.01）；与肺结核组比较，IFN⁃γ在糖尿病合并肺结核组AOD值降低（P<0.05）；与对照组比较，IL⁃10在肺结核组及糖尿病合并肺结核组的AOD值均降低（P<0.05）；与肺结核组比较，IL⁃10在糖尿病合并肺结核组的AOD值增高（P<0.05）。见表1。

3 讨论

在宿主抗结核免疫中，TNF⁃α协同IFN⁃γ募集巨噬细胞及淋巴细胞到结核病灶，并与IL⁃3通过嗜中性粒细胞及巨噬细胞作用使炎性反应局部化而发挥抵抗结核杆菌感染作用。IL⁃10能增加精氨酸酶1的活性使氮中间体明显减少，从总体上减弱巨噬细胞功能，并且能抑制保护性细胞因子TNF⁃α、IFN⁃γ的产生，使慢性结核分支杆菌感染者的肺组织内菌体大量复制［6，7］。而糖尿病在肺结核中是重要危险因素，目前已受到人们的广泛关注。在Vallerskog等［8］对糖尿病大鼠的研究中发现，给予低剂量、低毒性的结核分枝杆菌气溶胶感染大鼠后，其白细胞聚集延迟，结核分枝杆菌从肺组织到淋巴结的播散速度也延迟，认为这与IFN⁃γ在早期及中期较低水平相关，在糖尿病合并肺结核患者的血清中IFN⁃γ也明显降低［2］。由此可见，在结核分枝杆菌感染的过程中，细胞因子对于机体的免疫应答是至关重要的，糖尿病患者的Th1/Th2型细胞因子失衡可能是导致对结核分枝杆菌易感及免疫应答延迟，不易清除结核分枝杆菌的主要原因。

图1 细胞因子在肺组织中的表达情况 免疫组化×200Fig.1 Expression of cytokines in the lung tissue Histochemical staining×200

表1 3组肺组织中TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10的AOD计数表结果比较（n，±s）Tab.1 TNF⁃α，IFN⁃γ and IL⁃10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

表1 3组肺组织中TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10的AOD计数表结果比较（n，±s）Tab.1 TNF⁃α，IFN⁃γ and IL⁃10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

Compared with control group，1）P<0.05，2）P<0.01；compared with tuberculosis group，3）P<0.01，4）P<0.05.

Group n TNF⁃α IFN⁃γ IL⁃10Control group 13 0.224±0.064 0.242±0.015 0.185±0.049Tuberculosis group 45 0.283±0.075 0.292±0.067 0.115±0.0391）Tuberculosis with diabetes group 15 0.118±0.0502），3） 0.190±0.0684） 0.169±0.0571），4）

本研究发现，肺结核患者病灶中的TNF⁃α、IFN⁃γ的水平较对照组升高，但无统计学意义（P>0.05），可能是因为对照组的标本均来自炎性假瘤、支气管扩张及曲球菌感染等炎性反应性疾病，所以参与炎性反应的重要细胞因子TNF⁃α、IFN⁃γ的水平也有所升高，从而使两组间的差异性降低。其结果可以说明TNF⁃α、IFN⁃γ在维持和促进局部肺结核肉芽肿形成过程中的重要作用，与Bai等的研究结果一致［9］。TNF⁃α、IFN⁃γ的高表达，提示Th1型细胞免疫反应限制结核分枝杆菌的局部作用。而本研究中IL⁃10的水平在肺结核组较对照组降低，可以得出肺结核患者IL⁃10的缺失与低下将促进Th1型细胞相关因子的分泌及TNF⁃α的表达的推论，并且这一推论在Higgins等［10］对敲除小鼠IL⁃10基因的模型中得到同样证实。本研究还发现，糖尿病合并肺结核患者病灶中TNF⁃α、IFN⁃γ的水平较单纯肺结核组和对照组显著降低，糖尿病合并肺结核患者体内的Th1型细胞免疫功能受损，免疫应答反应延迟，不利于机体对结核分枝杆菌清除；而糖尿病合并肺结核组IL⁃10较肺结核组升高，IL⁃10的高表达使结核分枝杆菌逃离宿主的免疫监视，使糖尿病患者的肺结核感染病程迁延，糖尿病这一因素在肺结核的局部免疫中起抑制性作用，其免疫功能低下的原因可能是TNF⁃α等先天性免疫细胞因子及IFN⁃γ等Th1型细胞因子减少，IL⁃10等Th2型细胞因子升高而导致局部细胞免疫功能减弱所致。而糖尿病患者的Th1/Th2型细胞因子失衡，可能是导致其易患肺结核的重要原因之一。

综上所述，肺结核患者的结核病灶中TNF⁃α、IFN⁃γ的高表达对于促进肺结核局部炎性反应起着重要作用，而糖尿病合并肺结核患者的TNF⁃α、IFN⁃γ的低表达及IL⁃10的高表达，表明了糖尿病在肺结核发病过程中抑制细胞免疫功能，糖尿病患者Th1/Th2失衡将导致机体对结核分枝抗菌防御能力减弱。因此，进一步调控TNF⁃α、IFN⁃γ及IL⁃10表达，有可能成为提高糖尿病合并肺结核患者免疫功能（特别是局部的免疫功能）的一种新途径。

［1］Jeon CY，Murray MB.Diabetes mellitus increases the risk of active tuberculosis：a systematic review of 13observational studies［J］.PloSMed，2008，5（7）：1549-1676.

［2］Yamashiro S，Kawakami K，Uezu K，et al.Lower expression of Th1⁃related cytokines and inducible nitric oxide synthase in mice with streptozotocin⁃induced diabetes mellitus infected with mycobacteri⁃um tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol，2005，139（1）：57-64.

［3］Cilfone NA，Perry CR，Kirschner DE，et al.Multi⁃scale modeling predicts a balance of tumor necrosis factor⁃α and interleukin⁃10controls the granuloma environment during mycobacterium tubercu⁃losis infection［J］.PLoSOne，2013，8（7）：e68680.

［4］Kawai T，Akira S.TLRsignaling［J］.Seminars Immunol，2007，19（1）：24-32.

［5］Blanca I，Susan P，Paula A，et al.Tuberculosis in poorly controlled type 2diabetes：altered cytokine expression in peripheral white blood cells［J］.Clin Infect Dis，2008，47（5）：634-641.

［6］Turner J，Gonzalez⁃Juarrero M，Ellis DL，et al.In vivo IL⁃10pro⁃duction reactivates chronic pulmonary tuberculosis in C57BL/6Jmice［J］.Immunol，2002，169（11）：6343-6351.

［7］Schreiber T，Ehlers S，Heitmann L，et al.Autocrine IL⁃10induces hallmarks of alternative activation in macrophages and suppresses antituberculosis effector mechanisms without compromising Tcell immunity［J］.Immunol，2009，183（2）：1301-1312.

［8］Vallerskog T，Martens GW，Kornfeld H，et al.Diabetic mice display a delayed adaptive immune response to mycobacterium tuberculosis［J］.JImmunol，2010，184（11）：6275-6282.

［9］Bai X，Wilson SE，Chmura K，et al.Morphometric analysis of Th（1）and Th（2）cytokine expression in human pulmonary tuberculo⁃sis［J］.Tuberculosis（Edinb），2004，84（6）：375-385.

［10］Higgins DM，Sanchez J，Rosas AG，et al.Lack of IL⁃10alters in fl⁃ammatory and immune responses during pulmonary mycobacteri⁃um tuberculosis infection［J］.Tuberculosis，2009，89（2）：149-157.

（编辑 武玉欣）

The Expression Levelsand Significance of Cytokinesin the Lung Lesions of Tuberculosis Patients with Diabetes Mellitus

ZHANGFang1，YANGFei2
（1.InstituteofRespiratoryDisease，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；2.DepartmentofGeriatrics，ChestHospitalofShenyang，Shenyang110044，China）

ObjectiveTocomparecellularimmunefunctionandexploreitssignificanceinpatientswithtuberculosisortuberculosiscombinedwith diabetes.MethodsThe patients were divided into three groups：First group：13patients with benign lung lesions，Second group：45patients with tuberculosis，Third group：15patients with pulmonary tuberculosis and diabetes.Using immunocytochemistry SABCmethod，the expression of TNF⁃α and IFN⁃γ and IL⁃10in the lung lesions tissue were detected and compare the positive cells AODquantitative from every group.Variance analysis was performed after the rank transformation of AODvalues，then the LSDtest was employed for pairwise comparison.ResultsTNF⁃α，IFN⁃γ and IL⁃10is obvious expressed on the inflammatory reaction around the necrotic area.The TNF⁃α and IFN⁃γ AODvalues in the group of tuberculosis withdiabetesmellituswaslowerthanthegroupinthetuberculosisgroup（P<0.05）.TheTNF⁃α andIFN⁃γ AODvaluesinthegroupoftuberculosis group was higher than the control group（P>0.05）.The IL⁃10AODvalues in the group of tuberculosis with diabetes mellitus was higher than the group of tuberculosis（P<0.05）.The IL⁃10AODvalues in the group of tuberculosis was lower than the control group（P<0.05）.ConclusionOur results proved that the cytokines are involved in local immune response to tuberculosis such as TNF⁃alpha，IFN⁃gamma，IL⁃10.In addition，the diabetes patients are in local immune lower response.Regulating the cytokines in local tissue of diabetic patients could be a new method in immuno⁃therapy.

TNF⁃α；IFN⁃γ；IL⁃10；diabetes；tuberculosis

R521.9

A

0258-4646（2014）04-0313-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1440.010.html

辽宁省科学技术计划（2010225034）

张放（1965-），男，副教授，博士.E-mail：zhangfang001@yahoo.com

2014-01-28

网络出版时间：2014-04-2914:39

·论著·