阿托伐他汀对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中Wnt信号通路及相关因子表达的影响

李艳伟，于晓玲，申玉超（1.辽宁医学院附属第一医院老年病科高级医疗服务中心，辽宁锦州 11001；.沧州市中心医院重症医学科，河北沧州 061001）

阿托伐他汀对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中Wnt信号通路及相关因子表达的影响

李艳伟1＊，于晓玲1#，申玉超2（1.辽宁医学院附属第一医院老年病科高级医疗服务中心，辽宁锦州 121001；2.沧州市中心医院重症医学科，河北沧州 061001）

目的：研究阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Wnt信号通路及相关因子Wnt1、β-连环蛋白（β-catenin）及蓬乱蛋白1（dvl-1）表达的影响。方法：将体外培养的HUVECs分为空白对照组、ox-LDL（50mg/ L）组和低、高剂量（ox-LDL 50mg/L+阿托伐他汀0.5、10µmol/L）组，分别加入相应药物培养24 h后，用硝酸还原酶法测定各组细胞中一氧化氮（NO）含量，用免疫组化法和蛋白质印迹法检测各组细胞中Wnt1、β-catenin及dvl-1蛋白的表达。结果：与空白对照组比较，其他3组细胞中NO含量明显减少（P＜0.01），Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达均明显增强（P＜0.01）；与ox-LDL组比较，低、高剂量组细胞中NO含量均明显增加（P＜0.01），Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达均明显减弱（P＜0.01）。结论：阿托伐他汀能抑制ox-LDL诱导的HUVECs中Wnt信号通路及相关因子表达，其可能是阿托伐他汀抗动脉粥样硬化的机制之一。

阿托伐他汀；人脐静脉内皮细胞；Wnt信号通路；氧化型低密度脂蛋白

＊医师。研究方向：动脉粥样硬化与心血管疾病。电话：0416-4197632。E-mail：wenze2004222@126.com

#通信作者：主任医师，教授，硕士研究生导师。研究方向：动脉粥样硬化与心血管疾病。电话：0416-4197632。E-mail：gtxiaolingyu@ 163.com

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是具有较长一段无症状阶段的慢性进展性炎症疾病，疾病进展最终可致不稳定型心绞痛、心肌梗死、心源性猝死等急性心血管事件。近年来，内皮功能不全被多数学者认为是AS发生机制中的始动环节，因此对内皮细胞损伤进行药物干预治疗，也成为心血管疾病领域研究的一个新的趋势[1]。有研究证实，在高胆固醇血症所致的兔腹主动脉粥样斑块中β-连环蛋白（β-catenin）的mRNA和蛋白表达明显升高，提示β-catenin参与了AS的形成[2]，因此推断Wnt/β-catenin信号通路可能与AS的发生机制有关。本文拟通过研究阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）Wnt信号通路及相关因子Wnt1、β-catenin、蓬乱蛋白1（dvl-1）表达，探讨AS与Wnt/β-catenin信号通路的关系及阿托伐他汀抗AS的可能机制。

1 材料

1.1 仪器

CO2培养箱（美国Thermo forma公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；超速离心机（美国Sigma公司）。

1.2 药品与试剂

阿托伐他汀原料药（美国Sigma公司，批号：PZ0001，纯度：＞98%）；胎牛血清、1640培养基、胰蛋白酶购自北京海克隆生物有限公司；ox-LDL（广州奕源生物科技有限公司，批号：YB-002，规格：2.0mg/m l）；兔抗人Wnt1抗体（巴傲得生物科技有限公司）；鼠抗人β-catenin抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗人dvl-1抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 细胞

HUVECs购自美国ATCC公司。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

取HUVECs置于含10%胎牛血清的1640细胞培养液中，5%CO2细胞培养箱中培养，1～2 d换液1次，以0.25%胰蛋白酶消化及传代，并在倒置显微镜下观察细胞形态，选择生长良好的4～6代细胞用于试验。将细胞分4组，分别为（1）空白对照组，只有培养液，不加任何干预；（2）ox-LDL组：在培养液中加入终浓度为50mg/L的ox-LDL；（3）低剂量组：在培养液中加入终浓度为50mg/L的ox-LDL和0.5µmol/L的阿托伐他汀；（4）高剂量组：在培养液中加入终浓度为50 mg/L的ox-LDL和10µmol/L的阿托伐他汀。各组细胞加药培养24 h。

2.2 细胞形态学观察

用倒置显微镜观察各组细胞加药培养24 h后的形态学变化。

2.3 NO含量的检查

用硝酸还原酶法[3]，特异性将NO3－还原成NO2－，通过显色深浅测定各组细胞中NO的含量。

2.4 免疫组织化学法检测蛋白的表达

将第4代细胞接种在有盖玻片（经多聚赖氨酸处理）的6孔板中，进行细胞爬片，4℃10%福尔马林固定30m in，30% H2O2-纯甲醇（1∶9）室温浸泡15m in，封闭液37℃孵育30min，加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗体（1∶600）于4℃过夜；加二抗A液37℃孵育30min，加二抗B液37℃孵育30m in，显色、复染。以上每步之间用PBS冲洗3次，每次4 min，显色、复染，脱水、封片。镜下观察各组细胞中相应蛋白的表达。

2.5 蛋白质印迹（Western blot）法检测蛋白表达

收集各组细胞，超声裂解细胞，4℃1 000×g离心2min，取上清液，用考马斯亮蓝法对蛋白进行定量。取20µl蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别滴加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗体（1∶400），4℃孵育过夜，相应碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，碱性磷酸酶法显色。于扫描仪上成像，并用GENEGENIUS软件对条带进行灰度值半定量进行分析。以β-肌动蛋白（β-actin，分子质量为43 kDa）为内参，Wnt1（分子质量为40 kDa）、β-catenin（分子质量为92 kDa）及dvl-1（分子质量为76 kDa）与β-actin条带灰度值的比值代表各蛋白表达的相对量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 细胞形态学变化

镜下，空白对照组细胞呈单层铺路石状镶嵌排列，互不重叠，细胞边界清晰，呈多角形；ox-LDL组细胞收缩变圆，细胞间隙增宽，边界不清，部分细胞脱落；高、低剂量组细胞间隙较ox-LDL组窄，细胞形态趋于对照组，且高剂量组较低剂量组细胞形态更趋于对照组。各组细胞的倒置显微镜图见图1。

3.2 细胞中NO含量比较

与空白对照组比较，ox-LDL组和高、低剂量组细胞中NO含量均明显减少（P＜0.01）；与ox-LDL组比较，高、低剂量组细胞中NO含量均明显增加（P＜0.01），且高剂量组比低剂量组增加更明显（P＜0.01），具体结果见表1。

图1 各组细胞的倒置显微镜图A.空白对照组；B.ox-LDL组；C.低剂量组；D.高剂量组Fig 1 Inverted m icrograph of cellsA.blank controlgroup；B.ox-LDL group；C.low-dose group；D.highdosegroup

表1 各组细胞中NO含量和W nt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表达（±s，n＝6）Tab 1 The protein expressionsofW nt1，β-catenin and dvl-1（±s，n＝6）

表1 各组细胞中NO含量和W nt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表达（±s，n＝6）Tab 1 The protein expressionsofW nt1，β-catenin and dvl-1（±s，n＝6）

与空白对照组比较：＊P＜0.01；与ox-LDL组比较：#P＜0.01；与低剂量组比较：ΔP＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.ox-LDL group：#P＜0.01；vs.low-dosegroup：ΔP＜0.01

组别空白对照组ox-LDL组低剂量组高剂量组0.185±0.007 0.301±0.006＊0.257±0.004＊# 0.221±0.003＊#Δ 47.18±0.013 15.37±0.90＊26.33±0.58＊# 27.23±0.72＊#Δ 0.188±0.004 0.370±0.002＊0.267±0.005＊# 0.230±0.004＊#Δ 0.130±0.003 0.248±0.002＊0.203±0.004＊# 0.166±0.007＊#Δ dvl-1/β-actin NO，μmol/L Wnt1/β-actin β-catenin/β-actin

3.3 细胞中W nt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表达

空白对照组细胞质内均出现了Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的棕黄色淡染颗粒。与空白对照组比较，ox-LDL组细胞质内出现大量棕色颗粒聚集、浓染。高、低剂量组较空白对照组细胞质内出现较多棕黄色颗粒，但较ox-LDL组细胞棕黄色颗粒明显减少，且高剂量组较低剂量组细胞质内棕黄色颗粒减少。各组细胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达的光镜图见图2。

利用Western blot法，与空白对照组比较，ox-LDL组和高、低剂量组细胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明显升高（P＜0.01）；与ox-LDL组比较，高、低剂量组细胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明显降低（P＜0.01），且高剂量组较低剂量组降低更明显（P＜0.01）。各组细胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表达见表1。

4 讨论

图2 各组细胞中W nt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达的光镜图A.空白对照组；B.ox-LDL组；C.低剂量组；D.高剂量组Fig 2 Lightm icrograph of W nt1，β-catenin and dvl-1 protein expressionsA.blank control group；B.ox-LDL group；C.low-dose group；D.highdosegroup

血管内皮受损是AS发病的始动环节，尤其是对ox-LDL的摄取是AS起始和进展中的关键。Ross R[4]认为，AS的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受各种危险因素，尤其是ox-LDL的损伤，使血管局部产生的一种过度的慢性炎症增生反应。已有大量研究证实，ox-LDL通过其特异性受体氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）的介导激活多条炎症信号通路，在AS的形成及进展中对血管内皮造成炎性刺激损伤[5-7]。Wnt信号通路高度保守，与基因的表达、细胞的极性及细胞的黏附有关，它分为经典的Wnt信号通路（即Wnt/β-catenin信号通路）和非经典Wnt信号通路（包括非经典Wnt/Ca2+和Wnt/ JNK通路）[8]。本研究主要探讨Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路活化时，Wnt与Frizzeld受体结合激活细胞内的dvl，磷酸化的dvl将信号传至细胞内，抑制β-catenin等组成的复合物激酶的活性，引起β-catenin在细胞内的积累，并进入细胞核与T细胞因子（TCF）、淋巴细胞增强因子家族的转录因子形成复合物[9]，它可与钙联蛋白（Calnexin）启动子区结合，从而下调calnexin的表达[10]。calnexin表达减少，calnexin/catenin复合体减少，使内皮细胞间黏附功能下降，细胞间缝隙形成、通透性增加，从而导致炎症细胞易侵入血管内皮下而导致AS的形成。综上推断，Wnt/β-catenin信号通路激活与AS的形成有关。

阿托伐他汀通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HUG-CoA）还原酶，阻碍l-甲羟戊酸的生成达到降低胆固醇的目的。研究表明，他汀类药物在抑制炎症反应、修复受损血管、恢复血管内皮完整性、稳定斑块等方面发挥着关键作用[11-12]，从而预防心血管事件的发生。在实验中发现，他汀类药物能抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达[13]；阿托伐他汀钙能够上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，增加eNOSmRNA的稳定性，减少ox-LDL对eNOS的负向调节；阿托伐他汀钙可以选择性地维持NO介导的内皮依赖性动脉松弛[14]。

本研究显示，被ox-LDL诱导的HUVECs分泌的NO明显减少，同时Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达明显升高，由此推测ox-LDL有可能激活Wnt/β-catenin信号通路。在ox-LDL诱导HUVECs的同时加入阿托伐他汀，发现内皮细胞分泌的NO明显增加，同时Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达明显降低，因此推测被ox-LDL激活的Wnt/β-catenin信号通路被阿托伐他汀抑制；并且阿托伐他汀高剂量组较低剂量组内皮细胞分泌的NO明显增加，同时Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达明显降低，因此推测阿托伐他汀呈剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的HUVECs的wnt信号通路及相关因子表达。本研究结果提示，Wnt/β-catenin信号通路激活可能与AS的形成有关，而阿托伐他汀抗AS可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路及相关因子表达有关，并且这一作用随剂量增加而更加明显。

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Effects of Atorvastatin on W nt Signaling Pathway and the Exp ression of Related Factors in ox-LDL Induced Human Umbilical Vein Endothelial Cells

LI Yan-wei1，YU Xiao-ling1，SHEN Yu-chao2（1.Senior Medical Center for Senile Disease，The First A ffiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China；2.ICU，Cangzhou Central Hospital，Hebei Cangzhou 061001，China）

OBJECTIVE：To study the effects of atorvastatin on Wnt signaling pathway and the expression of related factors Wnt1，β-catenin and dvl-1 in oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）induced human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.METHODS：HUVECs culturedin vitrowere divided into blank control group，ox-LDL group（50 mg/L），low-dose and high-dose groups（ox-LDL 50 mg/L+atrovastatin 0.5，10µmol/L）.They were cultured w ith relevant drugs for 24 h；nitrate reductase method was adopted to determ ine the content of NO；and Wnt1，β-catenin and dvl-1 protein expressions were determ ined by immunohistochem ical method and Western blotting assay.RESULTS：Compared w ith blank control group，the content of NO decreased significantly in other 3 groups（P＜0.01），whileWnt1，β-catenin and dvl-1 protein expressions increased significantly（P＜0.01）；compared w ith ox-LDL group，the content of NO in ox-LDL low-dose and high-dose groups increased significantly（P＜0.01），while Wnt1，β-catenin and dvl-1 protein expressions decreased significantly（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Atorvastatin can inhibitWnt signaling pathway and the expression of related factors in ox-LDL induced HUVECs，whichmay be one of anti-atherosclerosismechanisms of atorvastatin.

Atorvastatin；Human umbilical vein endothelial cells；Wnt signaling pathways；Oxidized low density lipoprotein

R965

A

1001-0408（2014）17-1574-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.17.12

2013-12-18

2014-01-31）