骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞介导的炎症反应

张凯华，王飞，胡慧敏，黄华，安沂华，3

(1.首都医科大学，北京市神经外科研究所，北京 100050;2.首都医科大学，北京三博脑科医院，北京 100093;3.武警总医院细胞移植科，北京 100039)

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一种能够自我复制和多向分化的非造血多能干细胞［1，2］。近十余年来，已有大量实验证明了BMMSCs 的多向分化潜能、免疫调节特性、定向迁移能力和其与组织工程学材料联合移植用于修复各系统器官损伤的应用前景［3］。小胶质细胞是定居于中枢神经系统，参与调节固有免疫和适应性免疫应答的主要效应细胞。近来的研究表明，BMMSCs 移植可能通过调节小胶质细胞(MG)介导的免疫炎症反应发挥神经保护作用［4］，其具体机制有待进一步研究。本研究旨在通过体外细胞实验探讨BMMSCs 是否能够抑制小胶质细胞介导的炎症反应，进而发挥神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞

本实验所采用的小胶质细胞是首都医科大学神经科学研究所赠送的BV2 细胞系;所采用的实验动物是SPF 级2 周龄雄性SD 大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2009-0017】;无菌手术在北京市神经外科研究所动物实验室进行［SYXK(京)2013-0009］。

1.1.2 主要试剂与仪器

细胞培养基DMEM(high glucose)(Gibco 公司)，LPS(Sigma 公司)，小鼠TNF-α ELISA 试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)，奥林巴斯生物显微镜IX71(奥林巴斯)，二氧化碳细胞培养箱(Thermo 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 BMMSCs 的分离、培养及传代

脊椎脱臼法处死SD 大鼠，严格无菌条件下分离双下肢，DMEM(high glucose)培养液冲出骨髓，过200 目细胞筛后，将滤液于1000 r/min 下离心5 min，弃去上清液，以含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM(high glucose)培养液重悬沉淀，1 ×108/mL 密度接种，于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。24 h 后首次半量换液，以后每3 d 全量换液一次。待贴壁细胞达到80%融合后，按1∶2比例传代。

1.2.2 BV2 细胞的培养、传代

BV2 细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM(high glucose)培养液(同BMMSCs 所用培养基)，在5%CO2、37℃培养箱中培养，每天半量换液一次。待贴壁细胞生长至80%融合后，按1∶3比例传代。

1.2.3 实验分组及各组处理

实验分为4 组，组一:BV2 细胞以1 ×106/ mL的密度接种于加入DMEM(high glucose)培养液的六孔板中;组二:BV2 细胞以1 ×106/ mL 的密度接种于加入DMEM(high glucose)培养液的六孔板中，培养液中已预先加入LPS，LPS 终浓度为100 ng/mL;组三:将Transwell 小室放入六孔板中，上室接种BMMSCs，下室接种BV2 细胞，细胞密度均为1 ×106/ mL，两种细胞共培养于预先加入终浓度为100 ng/mL 的LPS 的DMEM(high glucose)培养液中;组四:BMMSCs 以1 × 106/ mL 的密度接种于加入DMEM(high glucose)培养液的六孔板中，培养液中已预先加入LPS，LPS 终浓度为100 ng/mL。实验各组所加培养基均为2mL，于同一恒温培养箱内培养6 h。

1.2.4 观察BV2 细胞形态变化

光学显微镜下观察比较组一、组二、组三中BV2细胞的生长状态，包括贴壁情况、细胞密度、细胞状态等。

1.2.5 观察BV2 细胞超微结构变化

制备电镜标本，透射电镜下观察比较组一、组二、组三中BV2 细胞的超微结构，主要包括核仁、线粒体、核糖体等细胞器的状态。

1.2.6 TNF-α 的测定

根据使用说明书，采用ELISA 方法测定四组中BV2 细胞炎症因子TNF-α 的分泌量。

2 结果

2.1 各组中BV2 细胞生长状态

光镜下观察各组细胞密度依次为:组一＞组三＞组二;组一中BV2 细胞密集，大部分细胞贴壁生长，绝大多数细胞呈典型的梭形形态，少见单个呈悬浮状态细胞，见图1A;组二中BV2 细胞稀疏，可见大量呈团块状悬浮状态的细胞团，贴壁细胞数量明显少于组一，同时可见多数细胞体积增大，形态不规则，呈阿米巴样，细胞突起增多增长，见图1B;组三中BV2 细胞密度小于组一，大于组二，可见少量呈小团块状悬浮状态的细胞团，较组二明显减少，细胞形态以梭形为主，阿米巴样细胞较组二明显减少，见图1C。组四中BMMSCs 生长密集，贴壁生长，形态不规则，呈梭形、纺锤形和多角形，见图2。

图1 BV2 细胞光镜下形态特征Fig.1 Microscopic appearance of BV2 cells

图2 BMMSCs 光镜下形态Fig.2 Microscopic appearance of BMMSCs

2.2 各组BV2 细胞超微结构改变

电镜下观察各组细胞可见，组一中可见部分分裂活跃的多核细胞，多数细胞胞核正常大小，核浆比例大致正常，线粒体、内质网稍肿胀，少见空泡样变，游离核糖体密集，可见大量有翻译功能的多聚核糖体，见图3A;组二中BV2 细胞内未见到多核细胞，可见胞核处于固缩、碎裂、溶解状态的凋亡细胞，部分存活细胞中可见核浆比例倒置，线粒体出现明显肿胀或者固缩，空泡样变较其他两组明显多见，游离核糖体相对稀疏，但是少见多聚核糖体，见图3B;组三中BV2 细胞内少见多核细胞，未见到处于固缩、碎裂、溶解状态的凋亡细胞，偶见核浆比例倒置细胞，线粒体、内质网形态正常，肿胀、固缩线粒体少见，空泡样变明显少于组二，游离核糖体密集，多聚核糖体多于组二、少于组一，见图3C。因光镜下明确组四中为典型的BMMSCs，与BV2 细胞超微结构比较无意义，所以未做该组电镜切片。

2.3 ELISA 方法检测TNF-α

采用ELISA 方法，严格按照说明书方法检测四组细胞上清液中的TNF-α，结果显示组三TNF-α 浓度明显低于组二;未被LPS 诱导激活的组一与不含小胶质细胞的组四浓度明显低于组二、组三，两组相比无统计学意义，见图4。

3 讨论

BV2 细胞是一种基本具备原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点，相对较易培养的成熟细胞系［5］，广泛应用于研究中枢神经系统免疫炎症反应方面的体外研究。LPS 可以诱导BV2细胞激活，建立BV2 细胞介导的神经炎症和毒性的经典细胞模型［6］。BMMSCs 的免疫调节特性及其临床应用也已被大量动物实验及临床前期研究证实［7］。本研究通过体外细胞实验探讨BMMSCs 在LPS 激活的BV2 细胞介导的免疫炎症反应中发挥的作用。

图3 BV2 细胞超微结构特征Fig.3 Ultrastructural features of the BV2 cells

图4 四组细胞上清液中的TNF-α 分泌量比较Fig.4 The quantity of TNF-α in the supernatant fluid of four groups

研究发现，BMMSCs 可以明显影响LPS 诱导活化的小胶质细胞的生长状态、超微结构及炎症因子的分泌。相同培养条件下，被同浓度的LPS 诱导活化后，光镜下可见共培养组的BV2 细胞无论从细胞密度、贴壁情况，还是呈团块状悬浮状态的失活细胞的数量，均明显好于非共培养的BV2 细胞组，说明相同程度的LPS 诱导激活条件下，BMMSCs 可以减轻炎症反应对BV2 细胞的损伤程度。透射电镜下比较前三组细胞超微结构可见，共培养组内处于核固缩、核碎裂、核溶解状态的细胞明显少于LPS 激活BV2 细胞组，说明相同程度的LPS 诱导激活条件下，BMMSCs 可以抑制炎症反应所导致的BV2 细胞凋亡。与共培养组和单纯BV2 细胞组相比，LPS 激活BV2 细胞组中呈肿胀或固缩状态的线粒体明显增多，核糖体密度明显减低，有翻译功能的多聚核糖体数目明显减少，说明相同程度的LPS 诱导激活条件下，BMMSCs 可以减轻炎症反应对BV2 细胞结构及功能的影响，因为细胞维持自身存活及进行分裂增殖等功能的过程中需要正常结构的线粒体提供能量，同时需要正常结构的核糖体作为细胞内蛋白质合成的分子机器，保证细胞各种功能的实现等等。以上均说明BMMSCs 能够减轻炎症反应过程中小胶质细胞受到的炎性损伤。

TNF-α 是一种具有代表性的炎症介质，在中枢神经系统炎症反应中发挥关键作用［8］。它由小胶质细胞产生并对小胶质细胞发挥细胞毒作用［9］。本实验结果显示，共培养组较LPS 激活BV2 细胞组TNF-α 有明显降低，说明BMMSCs 可以通过非细胞间接触的方式减少BV2 细胞分泌的炎症因子，减轻炎症反应的程度，对小胶质细胞介导的炎症反应起到抑制作用。国外虽然已有动物实验证明BMMSCs移植可以减少组织周围炎症因子TNF-1α、IL1β 等的表达量，但是并没有证明炎症因子的减少是BMMSCs 直接作用于小胶质细胞引起的，还是通过作用于其他细胞，比如中枢神经系统数量最多的星形胶质细胞来发挥作用，也没有证明这种作用是通过细胞间接触的方式还是旁分泌等其他的方式发挥作用。

综上所述，本实验结果表明:BMMSCs 能够通过非细胞间接触的方式抑制小胶质细胞介导的炎症反应，减少小胶质细胞分泌的炎症因子的表达，维持小胶质细胞正常结构和功能，进而发挥神经保护作用。虽然大量的研究已经报道过BMMSCs 的免疫抑制作用，但其潜在机制仍然不是很清楚，我们的研究说明BMMSCs 能够通过某种或某几种可通过扩散方式穿越Tranwell 膜的可溶性因子发挥其对免疫炎症反应的抑制作用，细胞间接触并不是间充质干细胞发挥抗炎作用的前提条件。本研究虽然初步证实了BMMSCs 对小胶质细胞介导的炎症反应的抑制作用，但是BMMSCs 的数量与其发挥抑制效应的关系及随着时间推移BMMSCs 抑制效应强弱的变化都有待于进一步研究，这些研究将为我们揭开BMMSCs 发挥免疫抑制效应的作用机制的神秘面纱提供线索、指明方向。

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